targetingsystems(targeting systems)dlar-4
cypridina-renilla 熒光素酶的雙重檢測(cè)
描述：
基于單一溶液的雙熒光素酶檢測(cè)試劑：
節(jié)省篩選應(yīng)用的成本和時(shí)間
已開(kāi)發(fā)出一組改進(jìn)的超靈敏分泌型熒光素酶報(bào)告基因，以分析同一組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的兩種不同啟動(dòng)子活性。這種方法還使人們能夠在不殺死細(xì)胞的情況下實(shí)時(shí)研究反應(yīng)，因?yàn)檫@三個(gè)報(bào)告基因是分泌的。targeting systems 提供了許多不同的細(xì)胞內(nèi)和分泌型雙熒光素酶檢測(cè)試劑。cycpridina -gaussia 螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)特別有吸引力，因?yàn)?cypridina 螢光素酶和 gaussia 螢光素酶在細(xì)胞內(nèi)和分泌部分都具有強(qiáng)大的活性，并且在使用該試劑進(jìn)行檢測(cè)時(shí)都具有穩(wěn)定的生物發(fā)光信號(hào)。renilla 熒光素酶生物發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性（圖 2）。
cypridina (vargula) 螢光素酶：來(lái)自海洋介形魚(yú) vargula hilgendorfi 的 cypridina 螢光素酶（以前稱為 vargula 螢光素酶）是一種分泌型螢光素酶，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 460 nm。它是已知的最亮的熒光素酶之一，具有最高的轉(zhuǎn)化率。
高斯熒光素酶：gaussia luciferase 是一種來(lái)自海洋橈足類 gaussia princeps (1,2) 的熒光素酶。這種不需要 atp 的熒光素酶在產(chǎn)生光的反應(yīng)中催化底物腔腸素的氧化，并且與其他發(fā)光報(bào)告基因相比具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，例如可分泌性和更亮的信號(hào)強(qiáng)度，以及出色的生物發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定性。大約 10% 在一小時(shí)內(nèi)衰減。從用表達(dá) gluc 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中測(cè)得的發(fā)光與產(chǎn)生的酶量成正比，這反過(guò)來(lái)又反映了轉(zhuǎn)錄水平?；蛘?，細(xì)胞裂解物可用于盡管大部分活性是分泌的，但 gaussia 熒光素酶的高靈敏度也允許從細(xì)胞裂解物中進(jìn)行測(cè)量。
生物發(fā)光信號(hào)和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性
圖a圖b
dlar-4 targetingsystems
圖2： 使用熒光素酶測(cè)定試劑在dlar-4系統(tǒng)中的不同熒光素酶報(bào)告熒光素酶活性的動(dòng)力學(xué)：建立反應(yīng)以測(cè)量轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣品中不同熒光素酶的熒光素酶活性的動(dòng)力學(xué)。使用 dlar-4 熒光素酶測(cè)定試劑測(cè)定熒光素酶活性。圖 a：使用 dlar-4 雙檢測(cè)系統(tǒng)的 vlar 組件時(shí) cypridina 熒光素酶生物發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性。圖 b：使用 gar-2 試劑和穩(wěn)定劑時(shí) gluc 生物發(fā)光信號(hào)的穩(wěn)定性。該試劑適用于需要檢測(cè)大量樣品的 hts 應(yīng)用。在沒(méi)有穩(wěn)定劑的情況下，信號(hào)強(qiáng)度最初略高，但比有穩(wěn)定劑時(shí)衰減得更快。注意：顯示的數(shù)據(jù)是在 turner td2020 光度計(jì)上測(cè)量的三次重復(fù)測(cè)定的平均值。
好處：
cypridina luciferase 和 gaussia luciferas 在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液和裂解物中都具有非常強(qiáng)的信號(hào)。因此可用作雙分泌型報(bào)告基因或雙胞內(nèi)報(bào)告基因。
天然 cypridina (vargula) 熒光素酶和 gaussia 熒光素酶具有天然分泌信號(hào)，并且在表達(dá)后有效分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。檢測(cè)熒光素酶不需要細(xì)胞裂解
cypridinaia 螢光素酶是已知最亮的螢光素酶之一，與常用的螢火蟲(chóng)螢光素酶相比，它具有最高的轉(zhuǎn)換數(shù)和更高的生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，使其成為理想的轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因 (1)。
gaussia 螢光素酶檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定劑成分在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)提供穩(wěn)定的動(dòng)力學(xué)，讓用戶有時(shí)間進(jìn)行高通量分析以及手動(dòng)交付的檢測(cè)。
分泌的 cypridina luciferas 蛋白是穩(wěn)定的，并且在產(chǎn)光方面具有*的活性，因此可以進(jìn)行非常靈敏的檢測(cè) (1,2)。
含有 vluc 和分泌型海腎熒光素酶（即轉(zhuǎn)染后的生長(zhǎng)培養(yǎng)基或細(xì)胞裂解物）的樣品可以在 -20°c 下長(zhǎng)期保存。
cypridina-gaussia luciferase dual assay reagent-dlar-4
套件內(nèi)容：
100x 腔腸素
儲(chǔ)存于 -20°c
gaussia 熒光素酶測(cè)定稀釋緩沖液 - 4°c 保存
gaussia 熒光素酶測(cè)定 (gar) 穩(wěn)定劑 - 4°c 保存
100x cypridina luciferin 底物 -儲(chǔ)存于 -80°c
cypridina 底物稀釋緩沖液 - 4°c 保存
vlar 緩沖液（cypridina 熒光素酶檢測(cè)緩沖液）- 4°c 保存
cypridina (vargula) 熒光素酶檢測(cè)緩沖液 - 4°c 保存
協(xié)議：
細(xì)胞上清液檢測(cè)：
gaussia 螢光素酶檢測(cè)
用所需量的 gaussia 熒光素酶測(cè)定稀釋緩沖液將 100x 腔腸素稀釋至 1x（每次測(cè)定需要 50 ul 稀釋試劑）。
將 5-20 µl 含有 gaussia 熒光素酶或 cypridina 熒光素酶的樣品移入每個(gè)孔或光度計(jì)管中進(jìn)行檢測(cè)
向每個(gè)樣品中添加 8 ul gar 穩(wěn)定劑（這是可選的，如果省略穩(wěn)定劑，則會(huì)獲得更高但不太穩(wěn)定的信號(hào)。
向每個(gè)樣品中加入 50 ul gaussia 熒光素酶檢測(cè)試劑（按步驟 1 所述制備）。混合均勻并在光度計(jì)中讀取。
cypridina (vargula) 熒光素酶測(cè)定
用 cypridina (vargula) 底物稀釋緩沖液將 10 µl vargulin 底物稀釋至 1 ml。
將 5-20 µl 含有 gaussia 熒光素酶或 cypridina 熒光素酶的樣品移入每個(gè)孔或光度計(jì)管中進(jìn)行檢測(cè)
向每個(gè)樣品中加入 40 ul vlar 檢測(cè)緩沖液。
將 20 ul 稀釋的 cypridina 熒光素底物（vargulin）按步驟 1 中所述制備，添加到每個(gè)樣品中?；旌暇鶆虿⒃诠舛扔?jì)中讀取。
細(xì)胞裂解物中螢光素酶活性的測(cè)定： gar 或 vlar 螢光素酶測(cè)定試劑也可用于測(cè)量預(yù)裂解細(xì)胞中的螢光素酶活性。注意：如果您需要測(cè)量細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性，請(qǐng)先使用 targeting systems 的細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞。（目錄號(hào) 5x clr-01）
用水稀釋 5x clr 緩沖液 1:5。
吸出細(xì)胞培養(yǎng)基并用無(wú)血清 dmem 洗滌細(xì)胞兩次。
添加足夠的 1x 細(xì)胞裂解緩沖液以覆蓋細(xì)胞。添加足夠的裂解緩沖液以覆蓋 cell.s（96 孔為 50 ul，12 孔為 300 ul，6 孔培養(yǎng)皿為 800 ul，10 cm 培養(yǎng)皿為 3 ml
在定軌振蕩器（室溫）上以 400 rpm 的速度搖動(dòng) 20 分鐘。
將 5-20 µl 含有熒光素酶的樣品或細(xì)胞裂解物與 100 µl 熒光素酶檢測(cè)試劑盒 (ts-1) 混合，并立即在光度計(jì)中讀數(shù)。
所有測(cè)定試劑在測(cè)定時(shí)應(yīng)接近室溫。
參考：
yamagishi, k.、enomoto, t. 和 ohmiya, y. (2006) anal。生物化學(xué)，354，15-21。
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4) br branchini、dm ablamsky、mh murtiashaw、l uzasci、h fraga 和 tl southworth (2007) 用于生物發(fā)光報(bào)告基因應(yīng)用的耐熱紅光和綠光螢火蟲(chóng)熒光素酶突變體。肛悶生物化學(xué)，2007 年 2 月：361(2)：253-62。
關(guān)鍵詞：振蕩器