本實(shí)驗(yàn)利用液相色譜法對(duì)番石榴葉粉中鞣花酸的含量進(jìn)行測(cè)定，為更廣泛地開(kāi)展番石榴葉開(kāi)發(fā)利用提供理論和。
1材料與方法
1.1材料與試劑
番石榴葉片，鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)fluka公司；甲醇(色譜純)；甲醇、鹽酸(均為分析純)。
1.2儀器與設(shè)備
lc-20ad液相色譜儀(配spd-20a紫外檢測(cè)器、sil-20a自動(dòng)進(jìn)樣器及cto-10a柱溫箱)日本島津公司；universal32r高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)德國(guó)hettich公司；elix5超純水儀美國(guó)millipore公司。
1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品40mg，轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度均為400mg/l的混標(biāo)溶液，隨后逐級(jí)稀釋至0.5、1、5、10、20、50、100、200mg/l。
1.4色譜分析條件
色譜柱為intersilods-sp色譜柱(250mm×4.5mm，5μm)，柱溫35°c，流動(dòng)相為3%冰乙酸(a)-甲醇(b)，梯度洗脫程序：0～4minb由20%升至45%，保持6min，10～15minb由45%升至70%，15～20min升至100%，保持1min；進(jìn)樣體積10μl。
1.5樣品處理
將所摘取的新鮮番石榴葉片分老葉、嫩葉、成熟葉，于105°c烘至質(zhì)量恒定，用粉碎機(jī)打成粉，分別準(zhǔn)確稱取1.0g粉末，放入100ml單頸瓶中，加入甲醇(含0.01%hcl)30ml，于70°c攪拌回流，2h后取出冷卻，用whatman4號(hào)濾紙過(guò)濾，即得番石榴葉片粗提取液，置4°c冰箱備用。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。
2結(jié)果與分析
2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣10μl，所得的色譜圖疊加如圖1所示，以標(biāo)樣質(zhì)量濃度y/(mg/ml)為縱坐標(biāo)、標(biāo)樣峰面積x/mv為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，計(jì)算線性回歸方程為y=108711x－45231，線性范圍為0.5～200mg/l，相關(guān)系數(shù)為0.9998。
2.2精密度實(shí)驗(yàn)
將同一番石榴葉提取液樣品(樣品代號(hào)2010.6.25)分裝于10個(gè)樣品瓶中，在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)來(lái)考查其測(cè)定的精密度，得出峰面積的rsd為0.6%，保留時(shí)間的rsd為0.06%。同時(shí)將該批樣品連續(xù)測(cè)定5d，得出峰面積的rsd為1.13%，說(shuō)明精密度良好。
2.3回收率實(shí)驗(yàn)
采用加標(biāo)樣回收法，稱取番石榴葉3份，每份樣量1.0g，分別加入1000μg/ml的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1ml，其他均按1.5節(jié)方法進(jìn)行，平行測(cè)定3次，計(jì)算回收率(回收率為用添加標(biāo)樣樣品的測(cè)出量減去樣品測(cè)出量，再除以加入的標(biāo)樣量，乘以100%)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明平均回收率為95.86%～98.31%。
2.4樣品分析
2.4.1色譜分離效果
按照上述色譜條件，將嫩葉、成熟葉、老葉各樣品進(jìn)樣10.0μl進(jìn)行液相色譜分析，所得樣品色譜圖見(jiàn)圖2，與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖1)比較，可確定峰1為鞣花酸，峰1與前后相鄰兩峰之間的分離度均大于1.5，說(shuō)明該梯度洗脫方法可以成功地分離鞣花酸和其他組分。
2. 4.2番石榴葉片中游離鞣花酸含量
從表2可看出，番石榴葉片中游離鞣花酸含量以幼嫩葉居多，成熟葉次之，而老葉中不含鞣花酸。
3討論
番石榴葉提取物，必須采用梯度洗脫方法才能有效地分離鞣花酸和其他組分。