本實(shí)驗(yàn)利用液相色譜法對(duì)番石榴葉粉中鞣花酸的含量進(jìn)行測(cè)定,為更廣泛地開(kāi)展番石榴葉開(kāi)發(fā)利用提供理論和。
1材料與方法
1.1材料與試劑
番石榴葉片,鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品美國(guó)fluka公司;甲醇(色譜純);甲醇、鹽酸(均為分析純)。
1.2儀器與設(shè)備
lc-20ad液相色譜儀(配spd-20a紫外檢測(cè)器、sil-20a自動(dòng)進(jìn)樣器及cto-10a柱溫箱)日本島津公司;universal32r高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)德國(guó)hettich公司;elix5超純水儀美國(guó)millipore公司。
1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
準(zhǔn)確稱取鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品40mg,轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到質(zhì)量濃度均為400mg/l的混標(biāo)溶液,隨后逐級(jí)稀釋至0.5、1、5、10、20、50、100、200mg/l。
1.4色譜分析條件
色譜柱為intersilods-sp色譜柱(250mm×4.5mm,5μm),柱溫35°c,流動(dòng)相為3%冰乙酸(a)-甲醇(b),梯度洗脫程序:0~4minb由20%升至45%,保持6min,10~15minb由45%升至70%,15~20min升至100%,保持1min;進(jìn)樣體積10μl。
1.5樣品處理
將所摘取的新鮮番石榴葉片分老葉、嫩葉、成熟葉,于105°c烘至質(zhì)量恒定,用粉碎機(jī)打成粉,分別準(zhǔn)確稱取1.0g粉末,放入100ml單頸瓶中,加入甲醇(含0.01%hcl)30ml,于70°c攪拌回流,2h后取出冷卻,用whatman4號(hào)濾紙過(guò)濾,即得番石榴葉片粗提取液,置4°c冰箱備用。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。
2結(jié)果與分析
2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
取各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣10μl,所得的色譜圖疊加如圖1所示,以標(biāo)樣質(zhì)量濃度y/(mg/ml)為縱坐標(biāo)、標(biāo)樣峰面積x/mv為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線,計(jì)算線性回歸方程為y=108711x-45231,線性范圍為0.5~200mg/l,相關(guān)系數(shù)為0.9998。
2.2精密度實(shí)驗(yàn)
將同一番石榴葉提取液樣品(樣品代號(hào)2010.6.25)分裝于10個(gè)樣品瓶中,在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積,并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd)來(lái)考查其測(cè)定的精密度,得出峰面積的rsd為0.6%,保留時(shí)間的rsd為0.06%。同時(shí)將該批樣品連續(xù)測(cè)定5d,得出峰面積的rsd為1.13%,說(shuō)明精密度良好。
2.3回收率實(shí)驗(yàn)
采用加標(biāo)樣回收法,稱取番石榴葉3份,每份樣量1.0g,分別加入1000μg/ml的鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1ml,其他均按1.5節(jié)方法進(jìn)行,平行測(cè)定3次,計(jì)算回收率(回收率為用添加標(biāo)樣樣品的測(cè)出量減去樣品測(cè)出量,再除以加入的標(biāo)樣量,乘以100%),結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明平均回收率為95.86%~98.31%。
2.4樣品分析
2.4.1色譜分離效果
按照上述色譜條件,將嫩葉、成熟葉、老葉各樣品進(jìn)樣10.0μl進(jìn)行液相色譜分析,所得樣品色譜圖見(jiàn)圖2,與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖(圖1)比較,可確定峰1為鞣花酸,峰1與前后相鄰兩峰之間的分離度均大于1.5,說(shuō)明該梯度洗脫方法可以成功地分離鞣花酸和其他組分。
2. 4.2番石榴葉片中游離鞣花酸含量
從表2可看出,番石榴葉片中游離鞣花酸含量以幼嫩葉居多,成熟葉次之,而老葉中不含鞣花酸。
3討論
番石榴葉提取物,必須采用梯度洗脫方法才能有效地分離鞣花酸和其他組分。