維生素d是一種脂溶性維生素，其具有促進(jìn)生長和骨骼鈣化，促進(jìn)牙齒健全、用于治療佝僂病、骨軟化癥等功能作用，是一種大家廣為熟知的營養(yǎng)元素?！吨袊幍洹?020年版《0722維生素d測(cè)定法》，保留原先的第1、二、三法外，新增加了第四法——柱切換二維液相法。
本次，小編和您一起探討新加入的第四法。
什么是柱切換二維液相法？
柱切換二維液相法是將不同選擇性分離柱組合，加強(qiáng)分離能力的聯(lián)用技術(shù)。柱切換液相色譜系統(tǒng)通常由第1維分離柱和第二維分離柱串聯(lián)組成，兩柱之間以切換閥作為接口，通過流動(dòng)相流路的改變，將部分或全部第1維柱流出的組分，導(dǎo)入第二維柱進(jìn)行二次分離，從而起到凈化目標(biāo)化合物，提高系統(tǒng)分離能力的作用。如果只是將部分組分導(dǎo)入第二維柱分析，通常又稱為中心切割二維液相法，用lc+lc表示；如果是全部組分全部導(dǎo)入第二維柱，通常稱為全二維液相色譜法，用lc×lc表示。
新增加的第四法，優(yōu)點(diǎn)有哪些？
《中國藥典》2020年版四部《0722維生素d測(cè)定法》，采用高效液相色譜法測(cè)定維生素d制劑中所含維生素d含量，以及維生素ad制劑或魚肝油中所含維生素d及前維生素d(折算成維生素d)的總量。
•當(dāng)待測(cè)藥品中無維生素a及其他雜質(zhì)干擾可用第1法測(cè)定，否則應(yīng)按第二法處理后測(cè)定；
•如果按第二法處理后，前維生素d峰仍受雜質(zhì)干擾，僅有維生素d峰可以分離時(shí)，則應(yīng)按第三法測(cè)定，或不經(jīng)前處理按第四法測(cè)定。第二法和第三法的供試液制備需要采用“正相收集、反相洗脫”，第三法為了進(jìn)一步去除前維生素d峰的雜質(zhì)干擾，還增加了水浴加熱再凈化的過程，前處理較為麻煩，一個(gè)實(shí)驗(yàn)常常需要2~3天時(shí)間來完成；
•第四法通過在線凈化的方式，省去了復(fù)雜的前處理步驟，讓儀器來代替復(fù)雜的人工操作！且相比較而言，第四法的儀器配置更為簡單，是藥品中維生素d檢測(cè)的不錯(cuò)選擇！
島津應(yīng)對(duì)方案
該方案在島津中心切割二維液相系統(tǒng)上進(jìn)行。系統(tǒng)配置包括一維二元高壓系統(tǒng)和二維四元低壓系統(tǒng)，兩個(gè)紫外檢測(cè)器，一個(gè)進(jìn)樣單元和一個(gè)柱溫箱；柱溫箱中裝載兩根不同性能的色譜柱，并通過加載一個(gè)高壓流路切換閥實(shí)現(xiàn)一維和二維的實(shí)時(shí)切換。
圖1. 島津二維液相(中心切割)系統(tǒng)
01前處理：
按照《中國藥典》2020年版四部通則0722維生素d測(cè)定法第四法要求進(jìn)行制備。
02分析條件：
第1維色譜柱：hilic-10(2.1x150 mm，3 µm)
第二維色譜柱：rx-sil(3.0x100 mm，1.8 µm)
第1維流動(dòng)相：a相：正己烷；
b相：正己烷-正戊烷-異丙醇(98：1：1)；
按下表程序進(jìn)行梯度洗脫
第二維流動(dòng)相：正己烷-正戊醇-異丙醇(996：2：2)，等度洗脫
流速：0.5 ml/min
進(jìn)樣體積：100 µl
柱溫：40℃
檢測(cè)波長：265 nm
收集管：聚醚醚酮(peek)管，內(nèi)徑0.0762 cm(0.03英寸)，20 m，容積約9 ml
03對(duì)照品溶液色譜圖：
取方法中的校正因子f2上機(jī)測(cè)試，得到對(duì)照品溶液色譜圖。其中第1維液相維生素d的理論塔板數(shù)超過2500，與前維生素d的分離度>5；各峰的重復(fù)性為0.76%~1.46%(n=5)，均滿足藥典的要求。
圖2. 對(duì)照品溶液第1維色譜圖(上)和第二維色譜圖(下)
04供試品溶液色譜圖：
取制備好的供試品溶液上機(jī)分析。在第1維色譜圖中，由于維生素a醇和油脂的干擾，前維生素d被大量雜質(zhì)峰包裹，無法檢測(cè)；將該時(shí)間段的物質(zhì)切入第二維色譜中繼續(xù)分析，前維生素d和維a醇、油脂等雜質(zhì)在第二維色譜圖中得到了有效的分離。
圖3. 供試品溶液第1維色譜圖(上)和第二維色譜圖(下)
05參與驗(yàn)標(biāo)工作：
島津廣州分析中心參與了該方法的驗(yàn)標(biāo)工作；制標(biāo)專家和島津工程師共同建立并驗(yàn)證了方法，方法可靠、穩(wěn)定，可有效地應(yīng)對(duì)《中國藥典》0722通則第四法柱切換色譜法。