一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
1、清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)及儀器
2、開啟冷凍切片機(jī)并將冷凍切片機(jī)預(yù)降至所需溫度(- 15~-20 ℃)
3、準(zhǔn)備好處理好的載玻片、刀片、膠水以及藥品
二、取材
解剖之后迅速取出所需的新鮮組織，用干紗布或?yàn)V紙擦干后不需固定直接取材(24×24×2mm*),以防形成冰晶造成切片中形成形狀不一的空泡,使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)移位。
注：取材中目的標(biāo)本既要明確也要確保其結(jié)構(gòu)的完整性，應(yīng)避免不必要的脂肪及壞死組織附著;要盡量剔除毛發(fā)、硬骨或鈣化物;保乳手術(shù)切緣由于脂肪組織較多,取材厚度不要超過 3mm，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整。甲狀腺及淋巴結(jié)組織要帶全組織被膜并除去多余的脂肪組織。
三、冷凍切片
1、取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上冰凍，用吸熱器壓住組織，至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片(1~3分種)。
2、將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平。
3、調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5 ～10μm間。
4、調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時(shí)，以切出完整、平滑的切片為準(zhǔn)。切好的組織在干凈的玻片上黏附時(shí)順著一個(gè)方向稍微用力輕輕一帶 ,可避免組織攤片過程中皺折 ,保證組織結(jié)構(gòu)的完整及切片的美觀。
注：①包埋劑的選用：包埋劑是對(duì)冷凍切片質(zhì)量一重要影響因素，包埋劑用量要適宜，過多或過少都會(huì)影響標(biāo)本冷凍質(zhì)量。常用的有三種包埋劑oct劑、b超藕合劑以及普通膠水。b超藕合劑適用于細(xì)胞豐富質(zhì)地較嫩的組織,普通膠水或 oct劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬組織。(oct包埋劑驟冷時(shí)固化，其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近，其還具有水溶性，不影響染色等優(yōu)點(diǎn)。)
②組織塊過小：先將少量膠擠在托架上預(yù)先放在冰凍機(jī)中冷凍,約30秒鐘左右待膠凝固時(shí)將小組織放上,組織周圍再加一些膠,再次置于冷凍機(jī)中冷凍,這樣組織被墊高,就能快速切出高質(zhì)量的切片。
③冷凍箱及冷凍頭的溫度高低，要根據(jù)不同的組織而定。溫度過低會(huì)導(dǎo)致組織塊過硬,切片碎裂,出現(xiàn)梯田狀薄厚不均或空洞;反之,溫度過高,組織塊硬度不夠 ,切片不易成形或成皺褶。數(shù)據(jù)圖1供參考。
④當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點(diǎn)。
⑤用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由于溫度相同，沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象。