標(biāo)簽：熒光檢測(cè)，熒光強(qiáng)度， 熒光定量pcr， 定量pcr，熒光筆
熒光定量pcr是pcr實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的pcr類型，下面歸納一下，客戶進(jìn)行pcr實(shí)驗(yàn)時(shí)常遇見(jiàn)的一些問(wèn)題。希望對(duì)具有pcr恐懼癥的伙伴們能有所幫助。
常見(jiàn)問(wèn)題一： 熒光定量pcr的類型有幾種？有何區(qū)別？
答：目前熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)常用的方法主要有兩種，即：sybr green i染料法和taqman探針?lè)?，兩者的主要區(qū)別在于：sybr green染料的特點(diǎn)是只與dna雙鏈相結(jié)合發(fā)出熒光，而當(dāng)熒光染料處在游離狀態(tài)時(shí)，不會(huì)發(fā)出熒光。所以在pcr循環(huán)體系中熒光信號(hào)強(qiáng)度與pcr產(chǎn)物的數(shù)量成正比例關(guān)系。染料法熒光定量的優(yōu)點(diǎn)是通用性比較強(qiáng)，幾乎適用于所有的熒光定量pcr反應(yīng)但也具有明顯非特異性。如果pcr反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)引物二聚體或者進(jìn)行非特異性擴(kuò)增時(shí)，該染料也會(huì)這些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合從而激發(fā)熒光，形成假陽(yáng)性信號(hào)，對(duì)pcr定量結(jié)果一定的干擾，從而影響到pcr定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。
常見(jiàn)問(wèn)題二：熒光定量實(shí)驗(yàn)中無(wú)擴(kuò)增曲線是什么原因?qū)е拢?br> 答：一般來(lái)說(shuō)，在熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)中，無(wú)擴(kuò)增曲線主要會(huì)有以下三種情況：
凝膠電泳時(shí)無(wú)條帶出現(xiàn)，無(wú)擴(kuò)增曲線。
這種情況需要考慮引物的設(shè)計(jì)是否合理？引物質(zhì)量是否正常？退火溫度設(shè)置是否合理？擴(kuò)增體系是否正常等等。
2.第二種情況比較容易出現(xiàn)的是在做電泳時(shí)會(huì)正常顯示條帶，但沒(méi)有明顯的擴(kuò)增曲線。這種情況有可能是探針合成過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題；如果探針過(guò)程正常，則需要檢查探針淬火溫度、程序參數(shù)設(shè)定問(wèn)題確排除后則可能是儀器故障導(dǎo)致。
3.另外，模板被降解或模板不足時(shí)也會(huì)出現(xiàn)無(wú)曲線擴(kuò)增現(xiàn)象。
常見(jiàn)問(wèn)題三：熒光定量pcr時(shí)，有哪些需要注意的？
答：在進(jìn)行熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)室時(shí)，需要注意以下幾點(diǎn)：
1.pcr實(shí)驗(yàn)室要有獨(dú)立的分區(qū)：一般pcr實(shí)驗(yàn)室的樣品處理區(qū)、pcr反應(yīng)制備區(qū)、pcr擴(kuò)增區(qū)，數(shù)據(jù)報(bào)告區(qū)等相互獨(dú)立使用放置dna污染；
2.配置標(biāo)準(zhǔn)品的工具，包括移液器、吸頭等單獨(dú)使用一套工具，并且移液器的吸頭是帶濾芯的標(biāo)準(zhǔn)吸頭。
3.盡量不要用記號(hào)筆或標(biāo)簽在pcr管上做標(biāo)記，以免影響儀器的熒光檢測(cè)4.pcr管或8排管使用完后，及時(shí)歸入在的廢棄放置區(qū)，不要與試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)的樣本混用。
5.每個(gè)步驟都需要做好防止dna貨rna污染措施。
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