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      田鼠催產(chǎn)素(OT)ELISA試劑盒課題研究

      發(fā)布時間:2024-09-27
      田鼠催產(chǎn)素(ot)elisa試劑盒課題研究
      田鼠催產(chǎn)素(ot)elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)原理
      田鼠催產(chǎn)素(ot)elisa試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)。往預(yù)先包被田鼠催產(chǎn)素(ot)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、hrp標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物tmb顯色,tmb在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的田鼠催產(chǎn)素(ot)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(od 值),計(jì)算樣品濃度。
      樣本處理及要求
      1. 血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
      2. 血漿:用edta或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
      3. 組織勻漿:用預(yù)冷的pbs (0.01m, ph=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的pbs(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應(yīng)9ml的pbs,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在pbs中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。
      4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:請1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
      注:標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
      需要而未提供的試劑盒器材
      1.酶標(biāo)儀(450nm)
      2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10ul、2-20ul、20-200ul、200-1000ul
      3.37℃恒溫箱
      4.蒸餾水或去離子水
      名稱
      96孔配置
      48孔配置
      備注
      微孔酶標(biāo)板
      8孔×12條
      8孔×6條

      標(biāo)準(zhǔn)品
      0.3ml*6管
      0.3ml*6管

      樣本稀釋液
      6ml
      3ml

      檢測抗體-hrp
      10ml
      5ml

      20×洗滌緩沖液
      25ml
      15ml
      按說明書進(jìn)行稀釋
      底物a
      6ml
      3ml

      底物b
      6ml
      3ml

      終止液
      6ml
      3ml

      封板膜
      2張
      2張

      說明書
      1份
      1份

      自封袋
      1個
      1個

      備注:
      1、標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:詳見說明書;
      2、經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μl樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時,可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
      注意事項(xiàng)
      1、嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
      2、洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
      3、消除板底殘留的液體和手指印,否則影響od值。
      4、底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
      5、避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
      6、在儲存和溫育時避免強(qiáng)光直接照射。
      7、平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
      8、任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
      9、不能使用過期產(chǎn)品。
      10、如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
      試劑準(zhǔn)備
      試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
      20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
      操作步驟
      1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
      2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl;
      3.樣本孔中加入待測樣本50μl;空白孔不加。
      4.除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(hrp)標(biāo)記的檢測抗體100μl,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
      5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μl),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。
      6.每孔加入底物a、b各50μl,37℃避光孵育15min。
      7.每孔加入終止液50μl,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的od值。
      實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
      以所測標(biāo)準(zhǔn)品的od值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到直線回歸方程,將樣品的od值代入方程,計(jì)算出樣品的濃度。
      試劑盒性能
      1、檢測范圍:詳見產(chǎn)品說明書。
      2、靈敏度:最di檢測濃度小于0.1u/l。
      3、特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
      4、重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10%,板間變異系數(shù)小于15%。
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