pcr反應(yīng)體系解析如下：
1、引物
引物與模板配對(duì)的長(zhǎng)度應(yīng)至少為17個(gè)核苷酸，最高不宜超過30個(gè)核苷酸，最佳長(zhǎng)度為20-24個(gè)核苷酸，如需插入酶切位點(diǎn)，應(yīng)在酶切位點(diǎn)5'端多加幾個(gè)堿基，有利于酶切。引物的（g+c）%含量組成應(yīng)均勻，盡量避免含有相同的堿基多聚體；兩個(gè)引物中（g+c）%含量應(yīng)盡量相似；引物內(nèi)部應(yīng)避免形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)；兩個(gè)引物之間不應(yīng)發(fā)生互補(bǔ)；特別是在引物3'端最好有富有g(shù)c，這樣退火后有利于3'端的延伸。人工合成的引物需經(jīng)過色譜層析或page純化，以除去未能合成至全長(zhǎng)的短鏈等雜質(zhì)。引物的終濃度一般為0.1-1μm左右，濃度太高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，太低則擴(kuò)增產(chǎn)物太少。
2、模板
模板可以是單鏈dna，也可以是雙鏈dna，質(zhì)粒dna的擴(kuò)增效率略低于線狀dna。模板量一般不需太多，不超過1μg為宜，因?yàn)槟０辶窟^多可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加，但是要考慮模板中靶序列的含量。例如：使用基因組為模板擴(kuò)增單拷貝或低拷貝靶序列，就需要適當(dāng)加大模板用量。
3、緩沖液buffer
緩沖液的ph值，鹽離子濃度、助溶劑成分等都會(huì)對(duì)pcr反應(yīng)產(chǎn)生影響。taq酶通用緩沖液ph值為8.4。mg2+濃度為1.5mm，可以適用于大多數(shù)pcr反應(yīng)，但它并非對(duì)任何模板和引物的組合都是最佳的。
4、dna聚合酶
50μl反應(yīng)體系可用0.5-5u酶，酶量的選擇與模板dna的量、擴(kuò)增片段大小等有關(guān)，酶量過多易發(fā)生非特異性反應(yīng)，而且可能增加突變的機(jī)率，尤其在進(jìn)行高保真擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)盡量減少酶量，但酶量過少時(shí)反應(yīng)性能會(huì)下降。