蛋白質(zhì)印跡(western blotting)：又稱為免疫印跡，根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合，半定量檢測樣品中的某種蛋白的方法?；驹硎峭ㄟ^特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進行著色。通過分析條帶的位置和條帶深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況。那么你知道wb實驗操作步驟有哪幾步嗎？讓我們一起來看看吧！
一、樣本制備蛋白提取
1.前期準(zhǔn)備：首先要了解你所研究蛋白的內(nèi)源表達(dá)水平，常用的數(shù)據(jù)庫如uniport、atlas、biogps，或查閱相關(guān)文獻(xiàn)。設(shè)置陽性對照，選擇內(nèi)參蛋白。
2.蛋白提?。菏莣estern blotting 的第一步，要求選擇樣本新鮮，降低背景，避免反復(fù)凍融，選擇合適的裂解液裂解樣本，選擇合適的蛋白酶或磷酸酶抑制劑，防止蛋白的降解和磷酸化信號的丟失。
二、蛋白濃度測定
蛋白質(zhì)濃度測定的方法包括lowry法、bradford法、bca法，常用的是bca法，基本原理是在堿性條件下，蛋白將cu+ +還原為cu+，cu+ 與bca試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。
之后加入loading buffer，含有變性劑，使蛋白質(zhì)變性，釋放二硫鍵，最后煮沸變性保存樣品于-20℃或-80℃。
三、上樣和電泳
1. 制備凝膠：根據(jù)蛋白分子量的大小，選擇合適濃度的分離膠，配膠的aps需要在4℃的冰箱中保存。配膠的試劑中，aps與temed是促凝劑，所以在加促凝劑之前，需先把其他組分混勻。
2.上樣：蛋白marker孔加入5-10μl，多選擇生物素化蛋白marker，其余蛋白總上樣量20-50μg，組織樣本稍多些上樣，盡量保持每個泳道的上樣量一致，空泳道用loading buffer補齊。
3. 電泳：接上電源后，先用80v恒壓電泳濃縮至溴酚藍(lán)指示劑到濃縮膠與分離膠交界處，成線狀，改為恒壓100v--120v直至溴酚藍(lán)電泳到凝膠底部，此過程約用時1.5h。
四、轉(zhuǎn)膜
1.膜的選擇：廣泛使用的是nc膜和pvdf膜
2.轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜的方法包括濕轉(zhuǎn)、半干轉(zhuǎn)、干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)是轉(zhuǎn)膜最完quan且應(yīng)用zui廣泛的方法，但是所需時間較長。
五、封閉和抗體孵育
1.封閉：目的是為了減少膜對一二抗的非特異吸附，降低背景。將nc膜從濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)中取出，并用tbst潤洗2次，每次5 min，然后進行封閉。
化學(xué)發(fā)光法：用含5% 脫脂奶粉的tbst（封閉液）浸泡nc膜，室溫?fù)u床封閉1-2h；
熒光法：含5% 脫脂奶粉的tbs，脫脂奶粉需選擇實驗室級別的。
最后再用tbst潤洗封閉后的nc膜3次，每次5 min。
2.抗體孵育：一抗能識別膜上不同種屬的蛋白，買經(jīng)過驗證的，二抗上帶有發(fā)光底物，只能識別一抗。
六、顯色曝光
常用的是化學(xué)發(fā)光，抗體上偶聯(lián)的hrp催化ecl發(fā)光底物顯色，取出洗滌的膜后，用濾紙吸干水分，放置于成像儀上，均勻滴加ecl工作液，排出氣泡，開始曝光。
更多wb實驗的操作步驟相關(guān)問題，請聯(lián)系北京百奧創(chuàng)新科技有限公司：