單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)是在單細(xì)胞水平對全基因組進(jìn)行擴(kuò)增與測序的一項(xiàng)技術(shù)，其原理是對分離的單個(gè)細(xì)胞的微量全基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進(jìn)行高通量測序，廣泛應(yīng)用于癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細(xì)胞分化、免疫機(jī)制、微生物等方向的研究。
獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物是準(zhǔn)確全面的測序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無偏好性的擴(kuò)增，在單細(xì)胞測序技術(shù)誕生的近二十年時(shí)間里，全基因組擴(kuò)增技術(shù)經(jīng)歷了幾次重大的變革，wga主要有三種方式：dop-pcr，mda，malbac。下面小編就來為大家介紹一下wga技術(shù)的演變歷程，以及怎樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的擴(kuò)增方式。
dop-pcr (degenerate oligonucleotide–primed polymerase chain reaction)
技術(shù)原理：簡并寡核苷酸引物pcr，引物的3'含6bp的隨機(jī)序列，可以隨機(jī)的和基因組dna結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對全基因組的擴(kuò)增[1]。
應(yīng)用范圍：因?yàn)閜cr的指數(shù)擴(kuò)增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導(dǎo)致擴(kuò)增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1m bin size的水平上，dop-pcr適合對染色體的cnv進(jìn)行定量。
商品化試劑盒：sigma-aldrich,genomeplexsinglecellwholegenomeamplificationkit。
圖1 dop-pcr技術(shù)原理[4]
mda (multiple displacement amplification)
技術(shù)原理：2001年由laskin團(tuán)隊(duì)發(fā)明，使用隨機(jī)的六聚體引物和φ29dna聚合酶進(jìn)行反應(yīng)，該聚合酶具有很強(qiáng)的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴(kuò)增產(chǎn)生50~100kb的核酸片段。同時(shí)由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性，φ29 dna聚合酶具有很高的復(fù)制保真性[2]。
應(yīng)用范圍：mda法比dop-pcr擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 dna聚合酶的高效率及高保真性，使得mda法在對snv的分析，以及構(gòu)建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢。但是，和dop-pcr相同，mda法依然是指數(shù)擴(kuò)增，因此依然存在pcr反應(yīng)的序列偏好性，然而，和dop-pcr不同的是，這種偏好性并不能重復(fù)，因此mda法不適合進(jìn)行cnv的分析。
商品化試劑盒：qiagen,repli-gsinglecellkit。
圖2 mda技術(shù)原理[4]
malbac (multiple annealing and looping–based amplification cycles)
技術(shù)原理：2012年由謝曉亮團(tuán)隊(duì)發(fā)明，擬線性的擴(kuò)增過程降低了指數(shù)擴(kuò)增的序列偏好性。擴(kuò)增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機(jī)序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合，經(jīng)過8~12個(gè)循環(huán)的擬線性擴(kuò)增后，再對這些環(huán)狀的擴(kuò)增子進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增[3]。
應(yīng)用范圍：malbac法的優(yōu)勢在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和mda不同，malbac的這種偏好性在不同的細(xì)胞之間是可重復(fù)的，因此可以通過對參考細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化后，進(jìn)行cnv的分析；另外，由于其擴(kuò)增的均一性，malbac法擴(kuò)增的等位基因敲除率更低。malbac的弱點(diǎn)在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此malbac在檢測snv時(shí)將會(huì)出現(xiàn)更多的假陽性；另外，由于它可重復(fù)性的序列偏好性，基因組上低擴(kuò)增的區(qū)域有時(shí)會(huì)在擴(kuò)增過程中丟失。
商品化試劑盒：yikon, single cell whole genome amplification kit.
圖3 malbac技術(shù)原理[4]
由上述的分析可見，mda和malbac各有優(yōu)劣，實(shí)際上在不同的文獻(xiàn)中，研究者也會(huì)根據(jù)研究目的的不同，采取不同的方式對基因組進(jìn)行擴(kuò)增，以滿足研究的需要[5-7]
picoplex特殊隨機(jī)引物起始的熱循環(huán)擴(kuò)增
picoplex技術(shù)相比于以往的pcr、mda、malbac為基礎(chǔ)的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)，操作簡便，擴(kuò)增重復(fù)性良好。特別設(shè)計(jì)的隨機(jī)引物（參加us patent 8，206，913）能減少引物二聚體的形成，從而提高引物和模板的配對效率。
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華雅思創(chuàng)rubicon*代理，*現(xiàn)貨，產(chǎn)品信息如下：
picoplex®wga kit：用于單細(xì)胞文庫構(gòu)建的全基因組擴(kuò)增解決方案
picoplex®dna-seq kit：單細(xì)胞 dna 文庫制備技術(shù)，適用于 illumina 所有 ngs 測序平臺(tái)
thurplex®dna-seq kit：更高的通量, 更好的性能, 用于所有 illumina 的 ngs 平臺(tái)
品牌/生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 單位
rubicon genomics r300381picoplex dna-seq kit 48
rubicon genomics r300672smarter® picoplex® single cell wga kit 96
rubicon genomics r300722picoplex single cell wga kit v3 96
rubicon genomics r400407thruplex dna-seq 96d kit 96
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