cr:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是一種用于放大擴增特定的dna片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊dna復(fù)制,pcr的特點,是能將微量的dna大幅增加。
pcr原理示意圖:
pcr儀的種類有:常規(guī)的普通pcr儀,梯度pcr儀,原位pcr儀,實時熒光定量pcr儀四類!
1、普通pcr儀
一般把一次pcr擴增只能運行一個特定退火溫度的pcr儀,稱之為普通pcr儀,也就是傳統(tǒng)的pcr儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運行。
普通pcr儀主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗、檢疫等。
2、梯度pcr儀:
一次性pcr擴增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度pcr儀。不同的dna片段其適合的退火溫度不同,通過設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴增,從而一次性pcr擴增就可以篩選出表達(dá)量高的適合退火溫度進(jìn)行有效的擴增。
梯度pcr儀主要用于研究未知dna退火溫度的擴增,這樣既節(jié)約時間,也節(jié)約成本。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的pcr用。梯度pcr儀多應(yīng)用于科研、教學(xué)機構(gòu)等。
3、實時熒光定量pcr儀
在普通pcr儀設(shè)計基礎(chǔ)上增加熒光信號激發(fā)和采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng),形成了具有熒光定量pcr功能的儀器。其pcr擴增原理和普通pcr擴增原理相同,在pcr擴增時加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記,使用引物和熒光探針同時與模板特異性結(jié)合擴增。擴增的結(jié)果通過熒光信號采集系統(tǒng)實時采集信號連接輸送到計算機分析處理系統(tǒng),得出量化的實時結(jié)果輸出。
熒光定量pcr儀有單通道,雙通道和多通道之分。當(dāng)只用一種熒光探針標(biāo)記的時候,選用單通道;有多種熒光標(biāo)記的時候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物,因為一次只能檢測一種目的基因的擴增量,需多次擴增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重pcr,實現(xiàn)一次檢測多種目的基因的功能。
實時熒光定量pcr儀的應(yīng)用:(1)動物疾病檢測:禽流感、口蹄疫、豬瘟、沙門菌、大腸埃希菌、胸膜肺炎放線桿菌、寄生蟲病等、炭疽芽孢桿菌。(2)食品安全:食源微生物、食品過敏源、轉(zhuǎn)基因、乳品企業(yè)阪崎腸桿菌等檢測。(3)科學(xué)研究:醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究、大學(xué)及研究所等。
4、原位pcr儀:
是用于從細(xì)胞內(nèi)靶dna的定位分析的細(xì)胞內(nèi)基因擴增儀。如病原基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等??杀3旨?xì)胞或組織的完整性,使pcr反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中,在細(xì)胞的靶dna所在的位置進(jìn)行基因擴增。不但可以檢測到靶dna,還能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置。于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有著重大的實用價值。