在透射光顯微鏡，標(biāo)本質(zhì)量并不總是借給自己容易觀察和圖像記錄在簡單明成像模式出色的對(duì)比度。 處理固有的低對(duì)比度的標(biāo)本，如細(xì)菌不染，超薄組織切片，貼壁活細(xì)胞的研究，依靠專門的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)，以協(xié)助這些成像幾乎透明的樣品。 在通過在樣品和背景之間的亮度分布差異非常小的變化樣品檢驗(yàn)結(jié)果未染色標(biāo)本，光吸收差的過程。 當(dāng)背景是明亮的，人眼需要至少10至20%的局部強(qiáng)度的波動(dòng)，以便能夠識(shí)別標(biāo)本的信息。 不幸的是，這種電平調(diào)制的很少見到有透明的標(biāo)本，其通常呈現(xiàn)幾乎看不見針對(duì)類似強(qiáng)度的背景。 術(shù)語透射光 ，在光學(xué)顯微鏡中使用時(shí)，是指其中光從照明源傳遞試樣的相反側(cè)的物鏡(因此，照明是通過樣品傳送的 )的任何成像模態(tài)。 在本節(jié)描述的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)代表了多種樣品制備方法，以及產(chǎn)生這對(duì)于觀察和成像有用強(qiáng)度的變化的光學(xué)技巧。
方法能夠增強(qiáng)對(duì)比度包括微分干涉對(duì)比（dic），偏振光，相位相反，霍夫曼調(diào)制對(duì)比，以及暗場(chǎng)顯微鏡(實(shí)施例在圖1中示出)。 幾個(gè)這些技術(shù)是由光原產(chǎn)于成像較厚植物和動(dòng)物組織，當(dāng)從焦平面去除區(qū)域的限制，而偏振光需要雙折射率(通常不存在于動(dòng)物細(xì)胞中一個(gè)顯著度)以產(chǎn)生對(duì)比。
圖1所示是各種被在透射光顯微鏡通常使用流行的對(duì)比度增強(qiáng)技術(shù)。 圖1中的薄的*分(一)揭示了用曙紅和蘇木精以產(chǎn)生明場(chǎng)成像模式下的色彩對(duì)比度的人基底細(xì)胞癌。 圖1(b)表示活hela細(xì)胞與相襯成像的塑料的組織培養(yǎng)容器中。 安裝在水性介質(zhì)中的中國麂細(xì)胞的固定培養(yǎng)都在圖1的(c)微分干涉對(duì)比圖像呈現(xiàn)。 在食鹽水溶液沐浴小鼠心臟肌肉的新鮮組織切片顯示在圖1(d)面板，其中使用霍夫曼調(diào)制(或zeiss varel)相反，斜光技術(shù)產(chǎn)生的對(duì)比度。 與暗場(chǎng)照明觀察輝煌明亮式暗對(duì)比度使用obelia水螅標(biāo)本圖1(e)所示。 后，兔骨骼肌纖維(圖1(f))是生物樣本是雙折射的，并且表現(xiàn)出在偏振光對(duì)比度之間。
明場(chǎng)照明
其中的所有形式的光學(xué)顯微鏡用于過去三個(gè)世紀(jì)的首要和喜歡的技術(shù)，明照明依賴于光的吸收，折射率，或顏色變化產(chǎn)生的反差。 作為光穿過樣品，即改變區(qū)域的方向，速度和/或波前的光譜產(chǎn)生時(shí)的光線被聚集和由物鏡聚焦的光的差距(對(duì)比度)。 在明場(chǎng)系統(tǒng)分辨率取決于物鏡和聚光鏡數(shù)值孔徑，和一個(gè)浸沒介質(zhì)上需要的試樣(對(duì)數(shù)值孔徑的組合超過2.3的值)的兩側(cè)。 數(shù)碼相機(jī)提供的寬動(dòng)態(tài)范圍和捕獲存在于明場(chǎng)圖象中的信息所需的空間分辨率。 另外，背景減除算法，使用平均以在光路中無試樣采取幀，顯著地增加對(duì)比度。
簡單明成像，以適當(dāng)調(diào)整對(duì)柯勒照明顯微鏡，提供的關(guān)于細(xì)胞輪廓，核的位置，并在未染色標(biāo)本較大囊泡的位置信息的程度有限。 對(duì)比在明成像取決于光的吸收，折射率或色差。 作為光通過試樣改變方向，速度或成像波前的光譜特性的光的差距(對(duì)比度)的開發(fā)。 該技術(shù)是用可見光吸收染料染色的標(biāo)本更為有用(如曙紅和蘇木;參見圖1(a))。 然而，普遍缺乏檢查未染色標(biāo)本時(shí)，在明模式的對(duì)比度使得這種技術(shù)相對(duì)無用的活細(xì)胞結(jié)構(gòu)的認(rèn)真調(diào)查。
相差
首先由荷蘭人弗里茨·澤爾尼克在1934年描述，相襯贏得了發(fā)現(xiàn)者的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)于1953年，而在活細(xì)胞革命性基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究。 該技術(shù)是理想的薄未染色標(biāo)本(如玻璃上培養(yǎng)的細(xì)胞)，這是大約為5至10微米厚的核以上，但低于在外圍厚微米。 這樣試樣幾乎沒有表現(xiàn)出任何的光吸收在光譜的可見部分和在明場(chǎng)和暗場(chǎng)照明人眼不能檢測(cè)到它們。 相襯(如在圖1(b)所示)采用一個(gè)光學(xué)機(jī)構(gòu)在相轉(zhuǎn)化的微小變化成振幅相應(yīng)的變化，這可以看作在圖像對(duì)比度的差別。 顯微鏡必須配備含有環(huán)形或匹配于一組含有相環(huán)(設(shè)計(jì)ph）中的后側(cè)焦點(diǎn)面物鏡的一系列的環(huán)的一個(gè)專門聚光鏡(相差物鏡也可以與熒光使用，但有輕微的減少傳輸)。 相襯是觀察或培養(yǎng)成像活細(xì)胞時(shí)，增加對(duì)比度的好方法，但通常會(huì)導(dǎo)致周圍的邊緣特征的輪廓暈。 這些光環(huán)是光的文物，往往減少的邊界細(xì)節(jié)的可見度。 該技術(shù)是沒有用的厚標(biāo)本(如植物和動(dòng)物組織切片)，因?yàn)橄嘁瓢l(fā)生扭曲圖像細(xì)節(jié)的焦平面刪除的區(qū)域。 此外，漂浮物和其他外的焦點(diǎn)相對(duì)象與蓋玻片成像粘附細(xì)胞干擾。
如圖2中所示，細(xì)胞的折射率和其周圍的水溶液之間和細(xì)胞質(zhì)(圖2(b))和細(xì)胞核(圖2(c))的之間的細(xì)胞內(nèi)的存在非常小的差異。 無顯著折射率差發(fā)生在蓋玻片和周圍介質(zhì)(圖2(a))。 相襯使得這些微小差異通過使用光學(xué)操縱，例如，它它們翻譯成可被目視觀察并記錄在強(qiáng)度差可見。 在這種情況下，所用的光學(xué)效應(yīng)包括光的波前通過試樣的不同部分行進(jìn)之間的相位關(guān)系的轉(zhuǎn)變。 期間通過細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)，或水的旅途中，光波通過小度錯(cuò)開(延遲)，因?yàn)檫@些媒體具有稍微不同的折射率(的介質(zhì)的折射率越高，較小的速度或光速在培養(yǎng)基中)。 其結(jié)果，已通過一個(gè)細(xì)胞核傳遞光波滯后于光波只有通過水的后面(比較圖2(a)和圖2的(c))。 滯后的量被稱為相移。 其進(jìn)入檢體之前，海浪仍在相(蓋玻片下方波前)，但是這是不再時(shí)，他們已通過具有不同折射率的各種材料傳遞的情況。 相移的量取決于波都通過它們的路徑通過什么媒體(折射率)，并且路徑是通過這些媒體多久。 人眼不能看到的顯微鏡圖像，這些相移，它僅能夠不同的強(qiáng)度和顏色來區(qū)分。 因此，相襯技術(shù)使用光學(xué)技巧來轉(zhuǎn)化相移為灰度值。
在相差顯微鏡構(gòu)造中，聚光鏡孔徑光闌被照亮通過在光方式的中空錐體聚光鏡光學(xué)部件的檢體的相位停止(其尺寸取決于物鏡和聚光鏡數(shù)值孔徑)所取代，如在圖中所示圖3(a)。 這些波前輸入的物鏡和在后焦平面在創(chuàng)建階段停止的圖像(物鏡瞳孔)。 物鏡后焦平面內(nèi)的是一期環(huán)或片，不僅衰減從聚光鏡的階段停止明亮，直接發(fā)出的光，而且還增加了一個(gè)恒定的相移這個(gè)光。 如果樣品中含有亞結(jié)構(gòu)具有混合的折射率，這些實(shí)體引導(dǎo)從直接波到新路徑的光(圖3中紅色虛線(一))。 由檢體衍射波前(實(shí)際上，包含結(jié)構(gòu)信息的那些)將不會(huì)穿過物鏡的相位環(huán)，這意味著它們將不會(huì)被衰減或延遲。 所有的波前的終重新組合，以形成由管透鏡的中間圖像。
該已全部在試樣通過細(xì)節(jié)阻礙不同程度的波前疊加在移和衰減波前在那里放大或衰減彼此(取決于相)的中間圖像中，形成在所觀察到的后的相位對(duì)比圖像目鏡。 中間圖像中這些干擾過程產(chǎn)生具有在試樣的折射率(和/或厚度)的變化的各種結(jié)構(gòu)的亮區(qū)和暗區(qū)。 對(duì)比度是通過選擇正確的相位差和衰減值，這是在物鏡孔徑的相位環(huán)的光學(xué)特性的函數(shù)產(chǎn)生。
相襯成像的主要神器出現(xiàn)在周圍的標(biāo)本邊界光線明亮的光暈 。 光暈發(fā)生在相差顯微鏡因?yàn)槲挥谖镧R相位片的環(huán)形相位延遲(和中性密度)環(huán)還發(fā)送從試樣小程度的衍射光的(它不限于單獨(dú)通過環(huán)繞波)。 的問題是由以下事實(shí)非衍射光(零階)的寬度包圍波前投影到由聚光環(huán)形相位片比所述相位差板環(huán)的實(shí)際寬度小復(fù)雜。 厚厚的標(biāo)本，常常表現(xiàn)出高度重疊的結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生嚴(yán)重的暈文物。 因此，相襯]是只推薦用于非常薄的試樣，其中的幾個(gè)結(jié)構(gòu)不是物理躺在彼此之上的方法。 在厚厚的標(biāo)本，細(xì)節(jié)可以混合成一個(gè)形象，說到底，不再是清晰可辨。
相襯要求，配備瞳孔或后孔附近的相環(huán)的特殊物鏡。 它們很容易由綠色碑文，它表示相應(yīng)的聚光鏡相光闌的大小來識(shí)別：ph1，ph2 ，或ph3的。 如果你持有這樣的物鏡對(duì)光和看到從螺紋端瞳孔，您將可以看到灰色/透明相環(huán)。 聚光鏡需要一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)階段停止時(shí)，根據(jù)附加到所述顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)換的相襯物鏡。 與數(shù)值孔徑所需環(huán)直徑增大(高孔所需要的大直徑（ph3），例如0.9在空氣或1.3與浸油)。 三個(gè)尺寸可供與足以為所有物鏡(如圖3(b))。 如果您使用的只有一個(gè)環(huán)的大小相襯，用于聚光鏡容易附著和可拆卸的外掛站就足夠了。 有幾個(gè)坐騎炮塔盤面較為方便，因?yàn)樗怂械娜嗾?，使成像過程非?？斓霓D(zhuǎn)換。 附加開口可用于必要在明照明和暗視場(chǎng)光闌的孔徑光圈。
它們已被安裝在聚光鏡之后，使得在物鏡光瞳相位光闌的圖像與相環(huán)中的光束路徑的位置正好對(duì)應(yīng)的相位站必須居中(見圖4的(c))。 定心是使用兩個(gè)小扳手(或螺絲起子，取決于顯微鏡模型)聚光鏡的轉(zhuǎn)臺(tái)盤上進(jìn)行的。 如果你想成為特別精確，使用定心望遠(yuǎn)鏡觀察物鏡后孔作出這些調(diào)整，如圖4所示。這個(gè)小配件看起來像一個(gè)目鏡和插入觀察筒到位目鏡的說明。 當(dāng)望遠(yuǎn)鏡被聚焦在物鏡的光瞳(后孔)，相位停止的位置可以清楚地觀察到。 再次，考慮物鏡瞳孔并把聚光鏡階段停止的鮮明形象重合到與物鏡相環(huán)。 這在圖4在圖4清楚地示出(a)和4(b)所示，相停止不與物鏡相位板對(duì)準(zhǔn)，而停止與相位板是在圖4的(c)完美的一致性。
在相襯一個(gè)標(biāo)本的圖象可以通過在物鏡的相位環(huán)的仔細(xì)選擇適當(dāng)?shù)剡x擇直接(非衍射)光束的相位差的影響。根據(jù)所選擇的相位差值，具有比其周圍高的折射率的對(duì)象出現(xiàn)或者更亮或比其周圍更暗。 這也被稱為正或負(fù)相襯。 在現(xiàn)代顯微鏡，正相對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)，在對(duì)象的暗設(shè)有它們的折射率增加。 效果模擬在更高的折射率產(chǎn)生高對(duì)比度特性的區(qū)域吸收到觀察者的眼睛。 這種印象被認(rèn)為是的，特別是與在水性介質(zhì)中的細(xì)胞和組織，因?yàn)榧?xì)胞核和細(xì)胞器，例如，出現(xiàn)比細(xì)胞質(zhì)暗。 對(duì)于一些應(yīng)用，如觀察的精子細(xì)胞，負(fù)相位對(duì)比度可能產(chǎn)生更多的標(biāo)本細(xì)節(jié)比傳統(tǒng)的正相位對(duì)比度。
微分干涉對(duì)比(dic)
微分干涉對(duì)比顯微鏡（dic;圖1(c))的要求平面偏振光和額外的光剪切(諾馬斯基)棱鏡夸大試樣厚度梯度和折射率的微小差異。 脂質(zhì)雙層，例如，產(chǎn)生由于在小區(qū)的水相和脂質(zhì)相之間的折射率的差在dic優(yōu)異的對(duì)比度。 此外，在相對(duì)平坦的粘附哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞，包括質(zhì)膜，細(xì)胞核，液泡，線粒體和應(yīng)力纖維，這通常產(chǎn)生顯著梯度小區(qū)邊界，容易并發(fā)dic成像。 在植物組織中，雙折射細(xì)胞壁降低dic對(duì)比度在有限的程度，但正確對(duì)準(zhǔn)的系統(tǒng)應(yīng)允許核和液泡膜，一些線粒體，葉綠體，并在表皮細(xì)胞稠染色體可視化。 微分干涉反差成像厚植物和動(dòng)物組織，因?yàn)?，除了增加的?duì)比度，dic展品寬孔口景深減小，創(chuàng)建厚的樣品的薄光學(xué)部分的一個(gè)重要的技術(shù)。 這種效果也是成像粘附細(xì)胞，以減少從漂浮物在培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的模糊是有利的。
微分干涉對(duì)比光學(xué)系統(tǒng)是基于偏振光對(duì)比度技術(shù)盡可能多使用的組件有關(guān)。 dic對(duì)于現(xiàn)代透射光顯微鏡比在反射光不同的，因?yàn)閮蓚€(gè)雙折射棱鏡被使用(參見圖6)，以及檢體的光程差由折射率差的積求出(試樣和其周圍的介質(zhì)之間的)和光路上的兩個(gè)點(diǎn)之間通過的光束穿過的厚度(幾何距離)(圖5)。 在微分干涉顯微鏡產(chǎn)生的圖像的特征在于*的陰影播送的外觀，就好像它們是從一個(gè)高度傾斜光源從單一方位角始發(fā)照亮。 不幸的是，這種效果，這往往會(huì)呈現(xiàn)在偽三維浮雕檢體(圖6(d))的，經(jīng)常被不知情顯微鏡假定為實(shí)際地形結(jié)構(gòu)的一個(gè)指標(biāo)。
圖6示出了類似于偏振透射光的微分干涉對(duì)比光束路徑。 在dic(相對(duì)于偏振光)，兩個(gè)雙折射棱鏡(圖6的(b))被插入到光列車，一個(gè)在聚光鏡和靠近物鏡光瞳的第二個(gè)。 聚光鏡棱鏡執(zhí)行先前直線偏振光(圖6(c))的一個(gè)矢量分解成垂直地偏振的兩個(gè)彼此振動(dòng)方向，并且橫向以這樣的方式移動(dòng)，這些分光束的波前的一個(gè)小的橫向位移發(fā)生，其中厚度或折射率的區(qū)域而變化。 如果這兩個(gè)部分光束現(xiàn)在通過*相同的結(jié)構(gòu)，會(huì)發(fā)生在試樣沒有進(jìn)一步程差(圖5(a)和圖5(c))的。 然而，如果兩個(gè)分光束看到稍微不同的條件下，他們每個(gè)人將經(jīng)歷伴隨它上的剩余行程的中間像平面(圖5(b))的一個(gè)稍有差異的路徑長度。
如所討論的，分割dic光束進(jìn)入和通過，他們的波徑是根據(jù)試樣的厚度變化，山坡，和折射率altered試樣。 這些變化會(huì)引起在通過的任何標(biāo)本細(xì)節(jié)緊貼在一起領(lǐng)域兩個(gè)光束的波路徑變化。 當(dāng)平行光束進(jìn)入物鏡，它們被集中在那里輸入的第二dic棱鏡，結(jié)合了兩個(gè)光束在一個(gè)限定的距離，棱鏡本身以外的后側(cè)焦點(diǎn)面的上方。 此刪除剪切(波之間的距離)和梁對(duì)之間的原始路徑差。 如在穿過試樣的結(jié)果，平行光束的路徑是相同的長度(光程差)，用于不同樣品的區(qū)域的不。
為了使光束干涉，不同的路徑長度的光束的振動(dòng)必須進(jìn)入同一平面及軸。 這是通過將上部dic光束組合棱鏡上方的第二偏振器(分析器)來完成。 光然后朝著在那里可以觀察到的強(qiáng)度和顏色差異的目鏡前進(jìn)。 設(shè)計(jì)結(jié)果中的檢體細(xì)節(jié)的一側(cè)出現(xiàn)明亮的(或可能有顏色)，而另一側(cè)看起來更暗(或其它顏色)。 此陰影效果賦予所述偽三維外觀被上述檢體。 相比，相差顯微鏡有在dic顯微鏡許多優(yōu)點(diǎn)。 與dic，能夠更充分地利用該系統(tǒng)的數(shù)值孔徑，并以提供光學(xué)染色(色)。 dic還允許顯微鏡來實(shí)現(xiàn)出色的分辨率。 充滿物鏡孔徑的使用使得該顯微鏡專注于一個(gè)厚的樣品的薄平面部分，而不從平面的上方或下方混淆圖像。 惱人的光暈，在相襯經(jīng)常遇到，是在dic圖像不存在，以及適當(dāng)?shù)南詈臀炇镧R可以用于這項(xiàng)工作。 重要的是要記住，是很重要的，然而，由于dic是基于偏振光原理，高雙折射標(biāo)本或那些嵌在雙折射材料不應(yīng)dic下觀察。
霍夫曼調(diào)制和varel對(duì)比
比喻通常被稱為“窮人的dic”，霍夫曼調(diào)制對(duì)比度（hmc）是一個(gè)斜照明技術(shù)，增強(qiáng)了通過檢測(cè)光學(xué)相位梯度的活細(xì)胞和組織的對(duì)比(見圖1(d))。 基本顯微鏡配置包括光學(xué)振幅空間濾波器，稱為調(diào)制器，其被插入到物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面。 光強(qiáng)度通過調(diào)制器的上方和下方的平均值，根據(jù)定義，然后所述待調(diào)制而變化。 耦合到物鏡調(diào)制器是放置在聚光鏡前焦平面引向試樣偏斜照明離軸狹縫孔。 不像在相差顯微鏡的相位板，所述霍夫曼調(diào)制器的設(shè)計(jì)不改變穿過的光的相位; 相反，它影響的主要零階極大產(chǎn)生對(duì)比。 霍夫曼調(diào)制對(duì)比不被使用在光學(xué)路徑雙折射材料(如塑料陪替氏培養(yǎng)皿)的阻礙，因此，該技術(shù)是用于檢查在與聚合材料構(gòu)成的容器的標(biāo)本更為有用。 在下行路上，hmc產(chǎn)生了許多渲染技術(shù)，一定程度上比相襯或dic對(duì)蓋玻片活細(xì)胞成像用處不大的光學(xué)構(gòu)件。
新開發(fā)的對(duì)比技術(shù)，其中相差與傾斜單側(cè)照明(類似于hmc)相結(jié)合，已經(jīng)開發(fā)了活細(xì)胞在培養(yǎng)容器中的檢查。 形如環(huán)形扇區(qū)的附加停止使用在照明側(cè)，允許單邊傾斜照明。 三個(gè)照明模式，單側(cè)暗場(chǎng)，varel(可變浮雕)對(duì)比度和傾斜明(類似于偏斜照明或hmc)由來自外部的移位停止在徑向方向上的內(nèi)側(cè)設(shè)置(見圖7)和一個(gè)段匹配環(huán)形移入位置。 該縫隙指示源照明穿過高吸收對(duì)物鏡孔的外圍，其通過依賴于外圈的密度的量抑制其強(qiáng)度的第二環(huán)。 光的衍射級(jí)通過物鏡而不受varel環(huán)被抑制。 如果要發(fā)生變化的源照明被抑制的程度也可以操縱該狹縫的位置。
取向是容易實(shí)現(xiàn)和由于狹縫的同心性維護(hù)。 此外，因?yàn)樵谖镧R的varel環(huán)位置的，varel和相襯環(huán)可在相同的物鏡相結(jié)合。 這使得在培養(yǎng)容器中的成像單元的一個(gè)非常低的價(jià)格的方法。 成像在傳統(tǒng)和常規(guī)組織培養(yǎng)應(yīng)用的問題都可以用這種方法來解決，這是活的對(duì)象(顯微)的檢查成功選項(xiàng)，以及具有不同光學(xué)厚度的范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)很容易與varel成像。 即使有一個(gè)彎曲的底培養(yǎng)容器允許產(chǎn)生一個(gè)有用的圖像。 相襯獨(dú)自有時(shí)會(huì)失敗，在這種情況下，因?yàn)橐粋€(gè)彎曲的腔底座就像一個(gè)鏡頭，損害相環(huán)的疊加。 滑塊包括兩個(gè)所提及的扇區(qū)，以允許從左側(cè)或右側(cè)進(jìn)行照明，根據(jù)需要。 這使得有可能對(duì)比電池甚至鄰近在微量滴定板中的孔的邊緣。
暗場(chǎng)照明
周圍的暗視野顯微鏡的方法，雖然被廣泛用于成像整個(gè)19世紀(jì)和20世紀(jì)透明標(biāo)本，在使用僅限于物理隔離的細(xì)胞和生物體(如圖1給出(e))。 在該技術(shù)中，聚光鏡引導(dǎo)光錐到在高方位角檢體，使得階波前不直接進(jìn)入物鏡前透鏡元件。 光穿過樣品被衍射，反射，和/或通過光學(xué)不連續(xù)性(如細(xì)胞膜，細(xì)胞核和內(nèi)部細(xì)胞器)使這些微弱光線進(jìn)入物鏡折射。 然后，標(biāo)本可以看作對(duì)一個(gè)原本黑色的背景明亮的物體。 不幸的是，由從焦平面除去對(duì)象散射光也向圖像，從而降低對(duì)比度和模糊檢體的細(xì)節(jié)。 這個(gè)偽影的事實(shí)，灰塵和碎屑在成像室也顯著向所得圖像有助于復(fù)雜。 此外，薄的粘附細(xì)胞經(jīng)常遭受非常微弱的信號(hào)，而厚植物和動(dòng)物組織重定向太多的光到物鏡路徑，減少了技術(shù)的有效性。
近，結(jié)合熒光顯微鏡一起使用時(shí)在發(fā)送暗場(chǎng)顯微術(shù)的新興趣已經(jīng)出現(xiàn)由于它的優(yōu)點(diǎn)。 暗視野顯微術(shù)是一種專門的照明技術(shù)，該技術(shù)利用了偏斜照明中，如上所述，以提高在該不能很好在正常明照明條件成像標(biāo)本的對(duì)比度。 人工黑暗的背景中在聚光鏡使用的環(huán)形止顯微鏡創(chuàng)建(見圖8)。 雖然聚光鏡光學(xué)然后照射樣品，他們這樣做與光的通過在所有方位角在其角度檢體傳遞的中空倒錐形，使得僅光與標(biāo)本特征的交互是能夠進(jìn)入顯微鏡物鏡以形成疊加到一個(gè)黑暗的背景標(biāo)本的鮮明形象。 創(chuàng)造高角，它是必要的物鏡孔徑為比照明光錐的內(nèi)孔徑較小(見圖8的(a))。 然而，具有集成可變光圈的物鏡還提供快門出即使它落入物鏡的孔徑錐間接光(如在圖8(b)所示)。 這允許用于暗場(chǎng)照明采用非常高的孔。 暗視野顯微鏡是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的工具。 它可以以高倍率有效地用于圖像活的細(xì)菌，或在低倍率查看和圖像的細(xì)胞，組織和整個(gè)支架。
偏振光
偏振光顯微鏡是一個(gè)對(duì)比增強(qiáng)技術(shù)，顯著地改善與其它技術(shù)相比，如明場(chǎng)和暗場(chǎng)照明，相差，微分干涉對(duì)比，熒光，和霍夫曼調(diào)制對(duì)比時(shí)與雙折射材料獲得的圖像的質(zhì)量。 偏光顯微鏡具有高度的敏感性，并且可用于針對(duì)廣泛的各向異性標(biāo)本的定性和定量研究。 定性偏光顯微鏡頗為流行的做法，但是，偏光鏡的數(shù)量方面，這是在晶體主要應(yīng)用，代表了更棘手的問題是主要由礦物學(xué)家，地質(zhì)學(xué)家，化學(xué)家和。 過在高度敏感的偏振光顯微鏡在過去幾年取得了穩(wěn)步的進(jìn)展已經(jīng)允許生物學(xué)家審查的幾個(gè)各向異性亞細(xì)胞集的雙折射性質(zhì)。
偏振光顯微鏡(圖1(f))的通過查看插入到聚光鏡之前的光列車和物鏡后交叉偏振元件之間的樣品進(jìn)行的。具有雙折射特性，如植物細(xì)胞壁，淀粉顆粒，和有絲分裂紡錘體，以及肌肉組織中的細(xì)胞，內(nèi)組件旋轉(zhuǎn)光偏振面，在暗背景上顯示鮮艷。 在圖1(f)中所示的兔肌肉組織是施加到活組織觀察偏光顯微鏡的一個(gè)例子。 注意，這種技術(shù)是由雙折射的發(fā)生在活細(xì)胞和組織的限制，并且還沒有被充分開發(fā)。 如上所述，微分干涉對(duì)比操作通過將一對(duì)匹配的相對(duì)的交叉偏振器之間諾馬斯基棱鏡，使裝備dic觀察任何顯微鏡還可以采用審查平面偏振光試樣簡單地通過從光路徑除去棱鏡。
有在偏振顯微鏡兩枚偏光元件(參見圖9)。 偏振器置于與固定在東 - 西方向其振動(dòng)方位角的試樣臺(tái)下方。 注意大多數(shù)商業(yè)顯微鏡這些元素可通過360度旋轉(zhuǎn)。 另一個(gè)極化(分析器)，這通常是與面向北南(但在一些顯微鏡再次轉(zhuǎn)動(dòng))的振動(dòng)方向?qū)R，置于物鏡上方并可以移入和移出作為所需要的光路的。 當(dāng)兩個(gè)偏振器和分析器被插入到光路中，其振動(dòng)方位角被定位成直角彼此。 在這種結(jié)構(gòu)中，偏振器和分析器被劃掉，沒有光穿過光學(xué)系統(tǒng)和黑暗的背景中存在的目鏡一個(gè)(圖9的(a))。 線性偏振光波被從振動(dòng)方向在自然光線通行的統(tǒng)計(jì)混亂篩選出特權(quán)平面偏光片產(chǎn)生。 光(普通和特殊波)的兩個(gè)正交分量在通過檢體不同的速度行進(jìn)，并且作為結(jié)果，觀察不同的折射率，被稱為雙折射 (來自術(shù)語雙重或雙折射衍生)的現(xiàn)象。 雙折射的定量度量等于所述波前折射率之間的數(shù)值差。 更快的波前首先出現(xiàn)從試樣產(chǎn)生具有較慢波前的光程差。 分析器重組兩個(gè)波前在相同的方向上行進(jìn)，并在同一平面中振動(dòng)的分量。 這種偏光元件確保兩個(gè)波前必須在重組的大對(duì)比度時(shí)的相同的幅度。
為偏振光成像的適當(dāng)?shù)呐渲檬窍鄬?duì)容易實(shí)現(xiàn)的幾乎任何顯微鏡。 聚光鏡(靠近孔徑光闌)下方偏振片確保樣品與通過聚光鏡直線偏振光的波前照射(參照?qǐng)D9的(a))。 分析器(第二偏振片)，其被定向以設(shè)置在90度到偏振片的角度的方位角，位于物鏡的后面。 管透鏡形成中間圖像，這是通過目鏡或到照相機(jī)成像平面投影。 如果沒有檢體放置在顯微鏡工作臺(tái)上，現(xiàn)場(chǎng)通過目鏡觀察將保持*黑暗。 當(dāng)照射時(shí)，許多標(biāo)本轉(zhuǎn)動(dòng)偏振光的振動(dòng)方向出由偏振片產(chǎn)生的平面。 這種標(biāo)本主要由雙折射材料，其中，折射率取決于入射光的振動(dòng)方向。 這主要是與晶體，例如淀粉或礦物質(zhì)(圖9的(c))的情況下，但也會(huì)發(fā)生與纖維(圖9(d))和聚合物。 如果這樣的材料的交叉偏振器和分析器之間的偏振顯微鏡下觀察，明亮的部分可以在圖像中可以看出，因?yàn)楣獗徊糠值赜煞治鰞x發(fā)送。
偏振光顯微鏡的光學(xué)列車還可以包括被稱為一個(gè)lambda或相位差板的輔助元件(圖9(a)和圖9(b))是，在定量分析時(shí)使用。 在偏振光，這拉姆達(dá)板轉(zhuǎn)換成對(duì)比的顏色。 如在相襯，光程差引起的顏色，雖然這一次在試樣偏振光和雙折射材料。 產(chǎn)生的潛在客戶通過干擾光線特定波長的消光路徑差(只有某些顏色保持從白光和創(chuàng)造美麗，彩色照片)。 偏光顯微鏡提供的大約的范圍內(nèi)的樣品的組合物和三維結(jié)構(gòu)的信息的巨大的量。 在其范圍內(nèi)幾乎是無限的，該技術(shù)可以揭示關(guān)于熱歷史以及其中試樣形成期間經(jīng)受的應(yīng)變信息。 在制造和研究有價(jià)值，偏光顯微鏡是相對(duì)便宜和可訪問的研究和質(zhì)量控制工具，它可以為用戶提供的任何其他技術(shù)不可用的信息。