奮森疏螺旋體pcr檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法：?
1.taqman探針?lè)ǎ?br>探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；pcr擴(kuò)增時(shí)，taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條dna鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與pcr產(chǎn)物的形成*同步。
取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。
②兩相分離 每1ml的trizol試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無(wú)色水相上層。rna全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的trizol試劑的60%。
③rna沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)rna酶的離心管中。加等體積yibing醇混合以沉淀其中的rna，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的rna沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
④rna清洗 移去上清液，每1mltrizol試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%yi醇(75%yi醇用depch2o配制)，清洗rna沉淀?；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤rna干燥 小心吸去大部分yi醇溶液，使rna沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
⑥溶解rna沉淀 溶解rna時(shí)，先加入無(wú)rna酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的rna溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測(cè)定先用稀釋用的te溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量rna溶液用te稀釋(1:100)后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定rna溶液 濃度和純度。
1.ⅰ法：
在pcr反應(yīng)體系中，加入過(guò)量sybr熒光染料，sybr熒光染料特異性地?fù)饺雂na雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的sybr染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與pcr產(chǎn)物的增加*同步。
定量pcr擴(kuò)增熒光曲線圖
pcr產(chǎn)物熔解曲線圖