中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
gb 31656.15-2022
食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)
水產(chǎn)品中甲苯咪唑及其代謝物殘留量的測(cè)定
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
national food safety standard-
determination of mebendazole and its metabolites residues in aquatic products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry method
1范圍
本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中甲苯咪唑及其主要代謝物羥基甲苯咪唑和氨基甲苯咪唑殘留量檢測(cè)的制樣和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。
本文件適用于魚、蝦和鱉可食組織中甲苯咪唑及其主要代謝物羥基甲苯咪唑和氨基甲苯咪唑殘留量的檢測(cè)。
2規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可（ke）少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
gb/t 6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法
gb/t 30891-2014水產(chǎn)品抽樣規(guī)范
3術(shù)語(yǔ)和定義
本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。
4原理
試樣中殘留的甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑和氨基甲苯咪唑，用乙酸乙酯提取，正己烷除脂，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。
5試劑和材料
除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合gb/t 6682規(guī)定的一級(jí)水。
5.1試劑
5.1.1甲酸（hcooh）：色譜純。
5.1.2乙酸乙酯（ch3coohc2h5）：色譜純。
5.1.3甲醇（ch3oh）：色譜純。
5.1.4正己烷（c6h14）：色譜純。
5. 1.5二甲基亞砜[(ch3)2so]：色譜純。
5.2溶液的配制
5.2.1 50 mmol/l磷酸氫二鈉溶液：取磷酸氫二鈉8.95 g，用水溶解并稀釋至500 ml。
5.2.2 0.1%甲酸溶液：取0.5 ml甲酸，加水溶解并稀釋至500 ml，混勻。
5.2.3甲醇-0. 1%甲酸溶液（50：50，v/v）：取甲醇、0.1%的甲酸溶液等體積混勻。
5.3標(biāo)準(zhǔn)品
甲苯咪唑（mbz），含量≥99.0%；羥基甲苯咪唑（mbz-oh），含量≥99.0%；氨基甲苯咪唑（mbz-nh2），含量≥99.0%；氘代甲苯咪唑（mbz-d3），含量≥99.5%；氘代羥基甲苯咪唑（mbzoh-d3），含量≥99.0%。具體見附錄a。
5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
5.4.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/ml）：取甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑和氨基甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，精密稱定，分別用10 ml二甲基亞砜溶解，加甲醇稀釋定容至100 ml容量瓶，搖勻。-18℃以下保存，有效期3個(gè)月。
5.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：精密量取甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑和氨基甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 ml，用甲醇-0.1%甲酸溶液稀釋配制成濃度為1 000 ng/ml、100 ng/ml、10 ng/ml3個(gè)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)工作液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。
5.4.3內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/ml）：取氘代甲苯咪唑和氘代羥基甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，精密稱定，分別用10 ml二甲基亞砜溶解，用甲醇稀釋定容至100 ml容量瓶，搖勻。-18℃以下保存，有效期3個(gè)月。
5.4.4混合內(nèi)標(biāo)工作液：精密量取氛代甲苯咪唑和氘代羥基甲苯咪唑內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 ml，用甲醇-0.1%甲酸溶液稀釋成含氘代甲苯咪唑和氘代羥基甲苯咪唑濃度分別為50ng/ml和10ng/ml的混合內(nèi)標(biāo)工作液。現(xiàn)用現(xiàn)配。
5.5材料
微孔尼龍濾膜：0.22μm。
6儀器和設(shè)備
6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（lc-ms/ms）：配電噴霧離子源（esi）。
6.2分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3離心機(jī)：8 000 r/min。
6.4渦旋混合器。
6.5超聲波清洗儀。
6.6氮吹儀。
6.7具塞聚丙烯離心管：50 ml.
7試樣的制備與保存
7.1試樣的制備
按gb/t 30891-2014附錄b的要求制樣。
a）取均質(zhì)后的供試樣品，作為供試試料；
b）取均質(zhì)后的空白樣品，作為空白試料；
c）取均質(zhì)后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。
7.2試樣的保存
-18℃以下保存。
8測(cè)定步驟
8.1提取
取試料2g（準(zhǔn)確至±0.05g），于50ml具塞離心管，準(zhǔn)確加入混合內(nèi)標(biāo)工作液100μl，渦旋振蕩2 min，加50 mmol/l的磷酸氫二鈉溶液5 ml，渦旋振蕩1 min，加乙酸乙酯6 ml，渦旋振蕩1 min，8 000 r/min離心6 min，收集上清液（乙酸乙酯層），殘?jiān)右宜嵋阴? ml重復(fù)提取1次，合并上清液，備用。
8.2凈化
取備用液，40℃氮?dú)獯蹈?，用甲?0.1%甲酸溶液2.0 ml溶解殘留物，加正己烷2 ml，渦旋振蕩1min，8000r/min離心6min，棄去上層正己烷層，重復(fù)去脂1次，取澄清液，過(guò)0.22μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。
8.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
精密量取標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作液適量，用甲醇-0.1%甲酸溶液稀釋成甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑的濃度均為0.5 ng/ml、1 ng/ml、2 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（內(nèi)標(biāo)氘代甲苯咪唑濃度為2.5 ng/ml、氘代羥基甲苯咪唑?yàn)?.5 ng/ml），供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。分別以各藥物濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值為橫坐標(biāo)（x）、各藥物的峰面積與同位素內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。
8.4測(cè)定
8.4.1色譜參考條件
a）色譜柱：c18（100 mm×2.1 mm，粒徑3μm），或性能相當(dāng)者；.
b）柱溫：30℃；
c）進(jìn)樣量：10μl；
d）流速：0.2 ml/ min；
e）流動(dòng)相：a為甲醇；b為0.1%甲酸溶液，梯度洗脫程序見表1。
8.4.2質(zhì)譜參考條件
a）離子源：電噴霧離子源（esi）；
b）掃描方式：正離子掃描；
c）噴霧電壓：3 500 v；
d）鞘氣壓力：30 l/min；
e）輔助氣壓力：15 l/min；
f）離子傳輸管溫度：350℃；
g）源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離電壓：12 v；
h）檢測(cè)方式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（srm），選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、碰撞能量見表2；
i）q1半峰寬：0.4 da；
j）q3半峰寬：0.7 da；
k）碰撞氣壓力：氬氣，0.2 pa。
8.4.3測(cè)定法
8.4.3. 1定性測(cè)定
在同樣測(cè)試條件下，試料溶液中甲苯咪唑及其代謝物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中的保留時(shí)間之比，偏差在±2.5%以內(nèi)，且檢測(cè)到的離子相對(duì)豐度，應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)?shù)男Ｕ龢?biāo)準(zhǔn)溶液相對(duì)豐度一致，其允許偏差應(yīng)符合表3的要求。
8.4.3.2定量測(cè)定
取試料溶液和標(biāo)準(zhǔn)工作液，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，甲苯咪唑以氘代甲苯咪唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，羥基甲苯咪唑和氨基甲苯咪唑以氘代羥基甲苯咪唑?yàn)閮?nèi)標(biāo)，以色譜峰面積定量，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)溶液及試料溶液中目標(biāo)藥物的特征離子質(zhì)量色譜峰峰面積均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄b。
8.5空白試驗(yàn)
取空白試料，除不加藥物外，采用完（wan）全相同的測(cè)定步驟進(jìn)行平行操作。
9結(jié)果計(jì)算和表述
試樣中待測(cè)物的殘留量按標(biāo)準(zhǔn)曲線或公式（1）計(jì)算。
式中：
x——試樣中被測(cè)物質(zhì)殘留量的數(shù)值，單位為微克每千克（μg/kg）；
cs——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測(cè)物質(zhì)濃度的數(shù)值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
cis——試樣溶液中內(nèi)標(biāo)濃度的數(shù)值，單位為納克每毫升（ng/ml）；
c’is——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)濃度的數(shù)值，單位為納克每毫升（ng/mll）；
ai——試樣溶液中被測(cè)物質(zhì)的峰面積；
a'is——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中內(nèi)標(biāo)的峰面積；
ais——試樣溶液中內(nèi)標(biāo)的峰面積；
as——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中被測(cè)物質(zhì)的峰面積；
v——試樣溶液定容體積的數(shù)值，單位為毫升（ml）；
m——供試試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為克（g）。
10檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
10. 1靈敏度
本方法甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑和羥基甲苯咪唑的檢測(cè)限均為0.5μg/kg，定量限為1μg/kg。
10.2準(zhǔn)確度
本方法添加濃度為1μg/kg~40μg/kg時(shí)，回收率均為70% ~120%。
10.3精密度
本方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤15%。