pcr反應(yīng)的特異性決定因素為:
①引物與模板dna特異正確的結(jié)合;
②堿基配對原則;
③taq dna聚合酶合成反應(yīng)的忠實性;
④靶基因的特異性與保守性。
1、其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及taq dna聚合酶耐高溫性,使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進行,結(jié)合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū),其特異性程度就更高。
2、 靈敏度高
pcr產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞;在病毒的檢測中,pcr的靈敏度可達3個rfu(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個細(xì)菌。
3、 簡便、快速
pcr反應(yīng)用耐高溫的taq dna聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在dna擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。
4、 對標(biāo)本的純度要求低
不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,dna 粗制品及總rna均可作為擴增模板??芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活pcr技術(shù)概論。