該試劑盒采用探針法四重實時熒光定量pcr技術(shù)，針對羊源、鴨源、豬源、牛源性成分核酸序列設(shè)計特異性引物和熒光探針，通過實時熒光定量pcr(taqman探針法) 擴增曲線判斷肉及肉制品中羊源、鴨源、豬源、牛源性成分核酸進行定性及定量檢測。
適用儀器：abi系列 (abi 7300/abi 7500/step one等)，羅氏lightcycler系列，伯樂cfx 96 ，北京鯤鵬基因x系列，三獅生物q162d等實時熒光定量pcr儀。
實驗操作：1. 樣本制備 (樣本制備區(qū))
參照總dna/rna提取試劑盒說明書，或使用es08全自動核酸提取儀配套快速核酸提取試劑盒 (磁珠法)，或其他符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的核酸提取試劑盒/方法，對樣本進行核酸提取。提取的核酸盡量及時進行檢測，否則于-20℃保存。
2.配制反應(yīng)體系 (加樣區(qū))
2.1 取出多重反應(yīng)液管，陽性對照管，陰性對照管，室溫條件下使試劑解凍，離心10秒，將管壁和管蓋內(nèi)的液體離心至管底，放在冰盒中備用。
2.2 取實驗所需的pcr反應(yīng)管 (n+2 ，即n個待檢樣本+陽性對照+陰性對照) ，反應(yīng)液充分吹吸混勻后，分別吸取 24μl反應(yīng)液至每個pcr反應(yīng)管內(nèi)，然后依次添加 1μl陰性對照、樣本核酸和陽性對照，蓋好管蓋，作好記錄，每個反應(yīng)總體積為 25μl 。充分混勻，離心 30 秒后在 實時熒光定量pcr儀上進行擴增實驗。
3.熒光pcr擴增 (擴增及產(chǎn)物分析區(qū))
95℃預(yù)變性 5 分鐘；95℃變性 10 秒，58℃退火延伸 30 秒，40 個循環(huán)，在 58℃時收集熒 光信號。熒光基團選擇fam/vic/rox/cy5 ，淬滅基團選擇none。
4.結(jié)果判定
4.1陽性對照fam/vic/rox/cy5 通道的ct值均＜30 且出現(xiàn)“s”型擴增曲線，陰性對照 無ct值或ct值≥40 且無“s”型擴增曲線，實驗結(jié)果有效；否則應(yīng)重新進行實驗。
4.2待檢樣本fam/vic/rox/cy5 通道的ct值≤36 且出現(xiàn)“s”型擴增曲線，判定為陽性。 fam通道陽性表明樣本中含有羊源性成分，vic通道陽性表明樣本中含有鴨源性成分，rox通道陽性表明樣本中含有豬源性成分，cy5 通道陽性表明樣本中含有牛源性成分。
4.3樣本檢測結(jié)果 36＜ct＜40 ，判定為可疑。應(yīng)對樣本進行復(fù)測，如復(fù)測ct值＜40 ，且有 明顯的擴增曲線，則判定為陽性，否則判定為陰性。
4.4 樣本檢測結(jié)果無ct值或ct值≥40 且無“s”型擴增曲線，判定為陰性。
關(guān)鍵詞：全自動核酸提取儀