488 caspase-3活細(xì)胞分析試劑盒說明書
產(chǎn)品描述
活細(xì)胞分析試劑盒包含 488 caspase-3底物和ac-devd-cho caspase-3/7抑制劑。 488 caspase-3 substrate為基于caspase-3/7活力檢測(cè)細(xì)胞凋亡提供了有效的工具，適用于熒光顯微觀察和流式細(xì)胞儀分析。
相較于其它基于（flica）分析的 caspase 的熒光底物或熒光抑制，試劑盒內(nèi)提供的substrate 檢測(cè)caspase-3/7 活性的同時(shí)不會(huì)抑制完整細(xì)胞的凋亡過程。substrate由耦合caspase-3/7 devd識(shí)別序列的熒光dna染料組成。substrate 最初無熒光，其會(huì)穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在凋亡細(xì)胞中caspase-3/7剪切substrate釋放高親和性的dna 染料，這種染料遷移到細(xì)胞核標(biāo)記dna 并發(fā)出明亮的綠色熒光。substrate 是雙功能的，既可以檢測(cè) caspase-3/7 活性，又能可視化細(xì)胞核在細(xì)胞凋亡進(jìn)行中的形態(tài)學(xué)變化。
使用方法
使用方法
1. 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化下面提供的實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)終點(diǎn)法檢測(cè)制度。488 substrate 可進(jìn)行細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間孵育過程研究。細(xì)胞密度、底物濃度和抑制劑濃度可能需要優(yōu)化。推薦底物濃度1-10 μm之間。細(xì)胞可在培養(yǎng)基、pbs或其他的緩沖液中孵育底物。對(duì)于貼壁細(xì)胞，建議更換新鮮含有底物的培養(yǎng)基，以防背景的不均一性。底物孵育后換液或洗滌細(xì)胞等操作可自由選擇。2. 對(duì)照設(shè)定
推薦設(shè)定以下對(duì)照：
a. 陰性對(duì)照：不誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞
b. 陽(yáng)性對(duì)照：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞
c. 抑制劑對(duì)照：誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡同時(shí)（或提qian10-30 min）孵育caspase-3/7抑制劑，最后再添加 488 caspase-3底物。
3. 抑制劑對(duì)照
試劑盒中所提供的caspase-3/7 抑制劑 ac-devd-cho 可用來確認(rèn)caspase-3/7 依賴于 488 的熒光信號(hào)。對(duì)于抑制劑對(duì)照，抑制劑的終濃度應(yīng)至少是底物濃度的2倍（例如當(dāng)使用5 μm 488 底物時(shí)，ac-devd-cho濃度為 10 μm）。添加底物前在室溫下孵育ac-devd-cho 15-30 min，加入底物后，孵育液中繼續(xù)保留抑制劑。ac-devd-cho 是可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。對(duì)于某些細(xì)胞類型有效的caspase-3/7 抑制劑需要使用不可逆的抑制劑，如z-devd-fmk，或需要在凋亡誘導(dǎo)之前或誘導(dǎo)過程中添加抑制劑。
4. 流式細(xì)胞儀分析
4.1 選擇合適的方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，未經(jīng)處理的細(xì)胞樣本作為對(duì)照。
4.2 對(duì)于貼壁細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前先用胰蛋白酶或其他方法消化細(xì)胞。
4.3 用細(xì)胞培養(yǎng)基或合適緩沖液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到106個(gè)/ml數(shù)量級(jí)。
4.4 添加200 μl 細(xì)胞懸液至流式細(xì)胞試管。
4.5 抑制劑對(duì)照樣本，用ac-devd-cho 處理細(xì)胞（見上文）。
4.6 200 μl細(xì)胞懸液中加5 μl 0.2 mm 的substrate并立即混勻使底物濃度為5 μm。不同類型細(xì)胞最佳底物濃度可能不同，需進(jìn)一步優(yōu)化。
4.7 室溫避光孵育15-30 min。
4.8 加入300 μl細(xì)胞培養(yǎng)基或pbs，使用流式細(xì)胞儀分析，選擇檢測(cè)綠色熒光的通道（激發(fā)/發(fā)射：485/515 nm）。
5. 熒光顯微鏡觀察
5.1 選擇合適的方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，未經(jīng)處理的細(xì)胞樣本作為對(duì)照。
5.2 抑制劑對(duì)照樣本，用ac-devd-cho 處理細(xì)胞（見上文）。
5.3 用含5 μm substrate 的新鮮培養(yǎng)基或pbs對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液（見試驗(yàn)優(yōu)化）。對(duì)于抑制劑對(duì)照組，抑制劑與底物一同孵育。
5.4 室溫孵育30 min 或更長(zhǎng)時(shí)間。
5.5 pbs或其它緩存液清洗細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，使用觀察綠色熒光的濾片（激發(fā)/發(fā)射：485/515 nm）。
6. 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)
6.1 將貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)在黑色96孔板中；對(duì)于懸浮細(xì)胞，調(diào)整密度至106個(gè)/ml，每孔加入0.2 ml細(xì)胞懸液。
6.2 選擇合適的方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，未經(jīng)處理的細(xì)胞樣本作為對(duì)照。（注意：細(xì)胞可能在管或瓶中處理，然后轉(zhuǎn)移到 96孔檢測(cè)板。）
6.3 抑制劑對(duì)照樣本，用 ac-devd-cho 處理細(xì)胞（見上文）。
6.4 對(duì)于懸浮細(xì)胞，直接添加substrate 混勻。對(duì)于貼壁細(xì)胞，用含有5 μm substrate的新鮮培養(yǎng)基或pbs對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液（見試驗(yàn)優(yōu)化）。對(duì)于抑制劑對(duì)照組，抑制劑與底物一同孵育。
6.5 細(xì)胞可以在含有substrate 的培養(yǎng)基中直接觀察。
6.6 對(duì)于懸浮細(xì)胞，輕輕震蕩重懸細(xì)胞。熒光酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。建議貼壁細(xì)胞使用底部閱讀方式。貼壁細(xì)胞密度的變化可能導(dǎo)致不準(zhǔn)確的讀數(shù)。
運(yùn)輸及保存方法
冰袋（wet ice）運(yùn)輸。儲(chǔ)存于4oc，至少可以儲(chǔ)存12個(gè)月。
注意事項(xiàng)
1、細(xì)胞可用hoechst 33342 染料（推薦濃度1 μm）共染，使細(xì)胞核產(chǎn)生藍(lán)色熒光染色（ex/em=346/460 nm）。
2、488 染料可用甲醛固定，但與甲醇固定不兼容。
3、經(jīng)甲醛固定的488染色細(xì)胞可用0.1% tritonx-100處理后行后續(xù)染色，但這樣處理后的染色亮度可能會(huì)減弱。
4、操作時(shí)請(qǐng)采取防護(hù)措施，穿防護(hù)服、戴一次性手套等。5、本產(chǎn)品僅作科研用途！
貨號(hào) 品名 規(guī)格 品牌
78dc10160-25t 488 caspase-3活細(xì)胞分析試劑盒 25t biohub
78dc10160-100t 488 caspase-3活細(xì)胞分析試劑盒 100t biohub