免疫熒光染色是一種常用的一種生物化學(xué)檢查方法，常用于組織學(xué)中抗原或抗體的定位，也可用于體液標(biāo)本中抗原或抗體的定量檢測。許多小伙伴，在做免疫熒光染色實驗時，碰到各種各樣的問題。事實上，掌握了免疫熒光染色實驗的原理、操作步驟及注意事項，要成功完成一項免疫熒光染色實驗并不難。
1、免疫熒光技術(shù)是什么?
免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術(shù)，主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白。免疫熒光技術(shù)既有抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，又能在熒光顯微鏡下清晰地顯示其形態(tài)，直觀性強。
免疫熒光染色實驗有兩種，包括直接免疫熒光法和間接免疫熒光法。
免疫熒光法原理圖
直接免疫熒光法是zui早的方法。其基本原理是用已知的抗體標(biāo)記上熒光素后成為特異性熒光抗體，染色時將該抗體直接滴在載玻片上進行孵育，使之直接與載玻片上的抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下直接觀察，作出判斷。
間接免疫熒光法的基本原理是用特異性的抗體與切片中的抗原結(jié)合后，繼用間接熒光抗體，與前面的抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗原抗體熒光復(fù)合物。在熒光顯微鏡下，根據(jù)復(fù)合物的發(fā)光情況來確定所檢測的抗原。
兩種方法，基本原理是一樣的。免疫熒光 (if) 或細(xì)胞成像技術(shù)使用抗體將熒光染料（也稱為熒光素或熒光物）標(biāo)記到特異性目標(biāo)抗原上，所用熒光染料有諸如異硫氰酸熒光素 (fitc) 等。而通過化學(xué)方法偶聯(lián)熒光素的抗體被廣泛使用于if實驗中。
直接免疫熒光法簡單易行、特異性高、快速方便，常用于腎活檢組織幾種免疫球蛋白的檢測和病原體的檢測。但其不足是只能檢測相應(yīng)的一種物質(zhì)，敏感性較差，效果有時不理想。
間接免疫熒光法由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光素抗體增多，發(fā)出的熒光亮度強，因而其敏感性強。所以間接免疫熒光法geng加常用，只需制備一種種屬熒光抗體，即可適用于多種第1抗體的標(biāo)記顯示。
2、免疫熒光染色實驗操作步驟
免疫熒光染色的操作方案通常包括：固定和透化、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再次洗滌以及測定讀數(shù)。本文以間接免疫熒光法為例，講講從固定到封片每個步驟的原理。
1）樣品準(zhǔn)備(sample preparation)
對于貼壁細(xì)胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培養(yǎng)細(xì)胞，然后到預(yù)定時間時進行固定等后續(xù)操作。也可以用潔凈的蓋玻片，70%乙醇中浸泡后，用無菌的鑷子放置到6孔板內(nèi)，然后用無菌的生li鹽水、pbs或培養(yǎng)液洗去殘留的乙醇。這時就可以種入細(xì)胞進行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼在蓋玻片上生長良好后，即可進行固定等后續(xù)操作。
對于懸浮細(xì)胞：把細(xì)胞先在固定液中固定，然后把細(xì)胞滴加在載玻片上，干燥后細(xì)胞會緊貼在載玻片上。然后就可以進行后續(xù)操作。如果細(xì)胞的粘附能力不佳，可以在載玻片上用pdl等物質(zhì)進行處理，以增強載玻片的粘附能力。
對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后，可以直接進行固定等后續(xù)操作。
對于石蠟切片：切片在二甲苯中脫蠟5分鐘，再換用新鮮的二甲苯脫蠟，共用二甲苯脫蠟3次。無水乙醇5分鐘，兩次。90%乙醇5分鐘，兩次，70％乙醇5分鐘，一次。蒸餾水5分鐘，兩次。
抗原修復(fù)：根據(jù)不同的抗原和抗體，可以選擇把切片放置在如下抗原修復(fù)液中，10mm檸檬酸鈉，ph6.0，或1mm edta，ph8.0，或10mm tris, ph10.0，95℃加熱12分鐘，大約在30分鐘內(nèi)緩慢冷卻至室溫。
2）固定
目的是保留組織的原始結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞形態(tài)和抗原的細(xì)胞分布。當(dāng)組織細(xì)胞死亡時，細(xì)胞發(fā)生分解，從其溶酶體和其他細(xì)胞器中釋放的酶，可以水解組織，這一過程稱為自溶。為了避免這種情況，固定組織細(xì)胞很有必要。
可以使用適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ汗潭?xì)胞或切片，固定完畢后，可以用免疫染色洗滌液(p0106)洗滌兩次，每次5分鐘。常用的固定劑有甲醛，戊二醛，甲醇/丙酮。不同固定劑所需時間和濃度不一，需要根據(jù)具體實驗進行探索。
3）破膜
破膜是為了讓抗體能與抗原有機會相見。因為免疫染色的基本原理就是讓抗原抗體相結(jié)合，然后標(biāo)記的抗體通過發(fā)熒光，使得我們可以對目的蛋白進行定性或定量分析。如果要檢測的抗原在細(xì)胞膜外表面或細(xì)胞外基質(zhì)，那么可以省去破膜步驟。因為在不破膜的情況下，抗體也能有機會與抗原結(jié)合。但是，如果需要檢測的抗原在細(xì)胞內(nèi)，則需要破膜，將細(xì)胞暴露于針對目的蛋白的第1抗體，以確?？贵w可進入表位。常用的破膜劑有triton x-100, np-40, brij-58, 皂苷, 洋地黃皂苷, 甲醇/丙酮。同樣，應(yīng)根據(jù)具體實驗進行破膜劑的選擇。
4）封閉(blocking)
封閉是使一抗的非特異性結(jié)合zui小化的重要步驟。在使用特異性的一抗與目的蛋白結(jié)合的過程中，如果有非特異性結(jié)合，則可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，較強的背景染色也會干擾目的染色的呈現(xiàn)，影響實驗結(jié)果的判斷。從理論上講，任何不結(jié)合靶抗原的蛋白質(zhì)都可以用于封閉。血清是一種常見的封閉劑，因為它含有與非特異性位點結(jié)合的抗體。用血清或蛋白質(zhì)封閉劑封閉可防止抗體與組織或fc受體非特異性結(jié)合。
從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
5）一抗孵育(primary antibody incubation)
事先選擇的特異性一抗可以與目的蛋白結(jié)合。這一步需要注意的是一抗是抗什么物種的。如果組織細(xì)胞來源是小鼠，則一抗應(yīng)該是某種動物抗小鼠，這里的某種動物是指一抗宿主，比如，一抗是羊抗小鼠，羊便是一抗宿主。
6）二抗孵育(secondary antibody inucubation)
第1抗體孵育后，洗掉未結(jié)合的一抗抗體，便可以進行一抗與二抗的結(jié)合。二抗應(yīng)該是針對第1抗體宿主物種的，熒光標(biāo)記的第二抗體。例如，一抗是羊抗小鼠，二抗應(yīng)該是某種動物抗羊，比如兔抗羊。
如果進行的是雙染，就要注意一抗二抗宿主的選擇，不要使其有交叉結(jié)合的可能。比如，組織來源是小鼠，有兩個目的蛋白需要檢測，一抗宿主應(yīng)該要不一樣，二抗應(yīng)有不同熒光標(biāo)記。針對a目的蛋白的一抗是羊抗小鼠，針對b目的蛋白的一抗可以是大鼠抗小鼠（大鼠和羊是不同一抗宿主），a二抗是帶有綠色熒光的兔抗羊二抗，b二抗是帶有紅色熒光的兔抗大鼠二抗，這種搭配是可以的。在熒光顯微鏡下，a目的蛋白染成了綠色，b目的蛋白則染成了紅色。但是，如果b一抗也是羊抗小鼠，則a二抗也會與b一抗結(jié)合，這時候就亂了，熒光鏡下一片綠。
7）封片
封片是指免疫染色后，使用固定介質(zhì)將蓋玻片粘附到組織切片或細(xì)胞涂片上。封片可以保護已染色的標(biāo)本，以免受到物理損害。進行封片的固定介質(zhì)也有助于提高顯微鏡下圖像的清晰度和對比度。
8）蛋白檢測(detection of proteins)
對于免疫熒光染色，此時已經(jīng)可以直接到熒光顯微鏡下觀察。
3、三種細(xì)胞免疫熒光染色實驗操作舉例
zo-1的免疫熒光
1）細(xì)胞在蓋片上生長融合到95%-時，從孵箱中取出。
2） 用預(yù)溫的1×pbs洗3次，每次10分鐘
3）4%的甲醛室溫固定20-30分鐘
4）1×pbs洗3次，每次10分鐘
5） 0.2%triton x-100透化2-5分鐘
6）1×pbs洗3次，每次10分鐘
7. 5%bsa室溫封閉30分鐘
8） 加一抗(用1%bsa稀釋)放在濕盒里，4度過夜
9）1×pbs洗3次，每次10分
10）加二抗（用1%bsa稀釋）30分鐘，閉光！!！
11）1×pbs洗3次，每次10分鐘
12） 95%甘油封片
注：4%甲醛，0.2%triton，5%bsa均用1×pbs稀釋
細(xì)胞爬片的免疫熒光
1）取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的培養(yǎng)皿里，pbs洗三遍。
有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小，夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加pbs不要太沖，不要細(xì)胞沖下來。洗的時候我都是多加pbs，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。
2） 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，pbs洗三遍。
3）0.2%triton x-100通透10分鐘，pbs洗三遍。
4） 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，pbs洗三遍。
5）一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，感覺前者效果hao，pbs洗三遍。
6）二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，pbs洗三遍。
7）用dapi染核，然后直接照熒光片。
8）蒸餾水洗掉pbs，甘油封片，指甲油封片子的四周，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂。
細(xì)胞免疫熒光簡單實驗
1）漂洗血清蛋白h7.2-7.4 37度 pbs 2小時.
2）-20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘
3）pbs洗凈:3min*3
4）1%triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpbs
5）pbs洗凈:2*5min
6）羊血清封閉：37度，20分鐘
7）一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度1-2小時
8） 4度pbs洗凈，3min*5次
9）二抗37度小于一小時
10） 37度pbs洗凈，3*5min涼干封片(封閉液ph8.5)
不管采用何種方法，在使用pbs緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下ph值，可以使用pbs多清洗幾次，也可以延長pbs清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時間。
4、免疫熒光染色操作注意事項
1）熒光試劑要放好
盡管許多熒光基團具有相對的光穩(wěn)定性，但在保存和染色過程中若未能避光，則可能導(dǎo)致熒光基團-抗體結(jié)合物降解，引起假陰性結(jié)果。因此，熒光物質(zhì)必須在建議溫度下小心保存，并始終注意避光，以保護其光譜完整性。
2）選擇熒光要謹(jǐn)慎
免疫熒光技術(shù)的一個主要優(yōu)勢在于它為多重檢測提供了機會，如今流式細(xì)胞儀能檢測每個細(xì)胞中20多個離散參數(shù)。在設(shè)計多重實驗時，應(yīng)考慮每種熒光基團的*性質(zhì)，如zui大吸收波長和zui大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。
3）合適對照不可少
任何實驗數(shù)據(jù)的分析都依賴于相關(guān)的對照，免疫熒光染色也不例外。每次試驗時 ，需設(shè)置以下三種對照：
（1） 陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物
（2） 陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物
（3） 熒光標(biāo)記物對照：pbs+熒光標(biāo)記物
5、免疫熒光實驗常見問題排除指南
1）背景染色太強
背景染色太強是指除了我們想看到的特異性染色在前臺唱主角演戲，還有一堆吃瓜群眾（與想看到的特異性染色顏色相同）在后面搶戲。
是什么原因?qū)е逻@些戲精搶了主角的戲呢？可能的原因如下。
組織切片太厚：這種情況下可以選擇將組織切片變薄試試。
封閉不佳:封閉的目的就是為了減少非特異性的結(jié)合，減少背景染色。如果背景太強，可以考慮換種封閉液或者增加封閉孵育的時間
二抗有非特異性結(jié)合：要想驗證是否如此，可以在染色過程中做個只加二抗的空白對照（也就是說不用特異性的一抗進行一抗的孵育過程，比如用一抗稀釋液進行孵育一抗的步驟）. 如果空白對照有染色，說明二抗有非特異性結(jié)合，這時候建議geng換一種二抗。
自體熒光:想知道組織是否有自體熒光，查看在非染色區(qū)域是否有熒光即可。有些自體熒光來自固定步驟，可以避免使用戊二醛固定，或者使用含0.1% 氫硼化鈉的pbs洗滌以除去游離的醛基。還有些熒光來自內(nèi)源性的熒光分子，可以用蘇丹黑/硫酸銅進行光漂白。
抗體濃度太高：降低所使用的抗體濃度或調(diào)整孵育時間。
洗滌不充分:染色有很多步驟，其中又包括很多洗滌的步驟。在實驗過程中，確保洗滌到位，不要偷工減料。
2）染色較弱或沒有染色
可能的原因如下：組織本身不存在你想研究的目的蛋白或者表達(dá)量很少。
如果懷疑目的蛋白并不存在，可以通過多種方式驗證，比如wb。因為不同探究蛋白的實驗的原理和操作會不一樣，所以可能得到的結(jié)果會不一樣，多種實驗的驗證geng有可能避免假陰性的出現(xiàn)。如果目的蛋白表達(dá)量很少，則可以考慮增加一個擴大熒光信號的步驟。
熒光顯微鏡的問題。
如果對熒光顯微鏡的參數(shù)設(shè)置不對，有可能導(dǎo)致看不到熒光。比如光源/濾光設(shè)備與你想檢測的熒光不匹配。每次拍照，記得檢查參數(shù)是否有誤。
曝光時間太短或吸光太少（gain值太低）:可以嘗試調(diào)大gain值并/或增加曝光時間，找到*值。
曝光時間太長，出現(xiàn)熒光淬滅：避免讓切片過度曝光。使用完立即將切片保存在黑暗處。
細(xì)胞/組織固定過度：因為過度固定可以讓抗原表位帶上面具，使得抗體無法與抗原結(jié)合，這樣當(dāng)然就沒啥熒光啦。所以可以嘗試減少固定的時間，也可以嘗試做抗原修復(fù)以顯現(xiàn)抗原表位。
組織/細(xì)胞干透:確保整個染色過程中，切片都處于潮濕環(huán)境。
細(xì)胞沒有通透，一抗進不去:舉例來說，如果你想研究的目的蛋白在細(xì)胞里面，但是抗體因為沒有金剛鉆，不能進入細(xì)胞里與目的蛋白長相廝守，那么你當(dāng)然看不到它們的愛情閃光點。所以呢，可以想辦法讓細(xì)胞開通綠色通道，搭個鵲橋。比如，如果使用甲醛固定組織細(xì)胞，可以用0.2% triton x-100（不同實驗可能所需濃度不一）通透細(xì)胞。如果是用甲醇或者丙酮固定的組織細(xì)胞，則不需要使用triton x-100，因為前者可以通透細(xì)胞。
一抗量不夠/孵育時間太短:提高抗體的濃度或增加孵育時間
一抗不合適：購買一抗前，記得閱讀產(chǎn)品信息，不是所有一抗都可以進行免疫熒光染色實驗的。另外，確保產(chǎn)品沒有過期。
一抗二抗不兼容：舉例來說，如果你的組織來源是小鼠，那么一抗應(yīng)該是某種動物抗小鼠，比如山羊抗小鼠，那么，此時二抗應(yīng)該是某種動物抗山羊，比如兔抗山羊。也就是說，二抗應(yīng)該是抗一抗宿主的。
切片儲存時間過長：樣品染色后應(yīng)該盡快觀察拍照，否則信號會隨時間減弱?？梢钥紤]將切片保存在 4?c 避光處，盡量延長儲存時間。
抗體儲存問題：避免反復(fù)凍融抗體，因為可能會引起抗體出現(xiàn)降解。建議買了抗體后，根據(jù)實驗每次的需求，將抗體分成多個小份保存，這樣每次使用一個小管即可。另外，儲存前記得看說明書，根據(jù)說明書的指示進行保存。比如具體保存溫度，是否要避光等。
小結(jié)：希望上面這些小貼士，能幫助大家成功完成免疫熒光染色實驗