逆轉錄（rt）以及隨后進行的pcr（rt－pcr）是rna 分析中使用得zui廣泛的技術之一。如果需要平行分析多個rna 樣品，方法為一步法rt－pcr。如果要擴增困難目標片段或從單一cdna 池中擴增多重目標片段則會選擇兩步法。eppendorf 推出的全新的cmaster rtpluspcr 系統(tǒng)適用于各種rt－pcr 應用。它含有一種全新的重組逆轉錄酶和一種具有高保真性的pcr 酶混合物。另外，rtpluspcr反應緩沖液能夠自動調節(jié)鎂離子濃度，因此這一重要成分的濃度無需優(yōu)化。這種自我調節(jié)的效果是通過對鎂離子的弱螯合作用來實現的。如果鎂離子濃度過高，螯合劑會與過剩的鎂離子結合，如果反應（taq 或dna）需要鎂離子，鎂離子就會被釋放出來。這種創(chuàng)新技術提高了cmaster rtpluspcr的靈敏度和特異性。使cmaster rtpluspcr試劑盒既能進行一步法，又能進行兩步法rt－pcr，而且具有很大的動力學檢測范圍，能擴增得到的pcr產物長度范圍也很大（一步法反應zui長可擴增5.3 kb片段；兩步法方案zui長能擴增12.3 kb 片段）。
下面的實驗可以展示該試劑盒在不同應用中的表現。
實驗1關注新試劑盒在一步法rt－pcr 中的靈敏度。而在一步法應用中，zui重要的因素就是能夠采用盡可能少的目標材料進行有效工作。
實驗2顯示應用一步法方案進行長距離rt－pcr 不再是個難題。試劑盒中創(chuàng)新的緩沖液能同時保證逆轉錄酶和高保真酶混合物都具有延伸性。
本系統(tǒng)提供的兩步法rt－pcr 備選程序適用的模板范圍很廣。實驗3描述了對不同模板的擴增情況。這個新的系統(tǒng)能為所有的rt目標提供全面解決方案，不論需要擴增的片段是中等長度還是極長，不同來源的總rna 中轉錄本是低豐度還是高豐度。
材料和方法
eppendorf cmaster rtpluspcr系統(tǒng)
eppendorf perfect rna eukaryotic試劑盒
所有的pcr反應均在eppendorf mastercycler® gradient梯度pcr儀上進行。
實驗1：一步法靈敏度檢測rt－pcr
擴增目標：500 bp 的人α微管蛋白mrna 片段。
模板rna：從人hela細胞中純化的總rna。反應中應用的模板濃度從1μg遞減至10pg。
方案：eppendorf cmaster rtpluspcr系統(tǒng)，標準一步法rt－pcr方案。1:10 稀釋rtpluspcr 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mm，反應總體積50μl
循環(huán)參數：
循環(huán) 步驟 溫度 時間 描述
1x 1 50°c 30分鐘 逆轉錄
1x 2 94°c 3分鐘 初始變性
40x { 3 94°c 15秒 模版變性
4 68°c 45秒 引物退火/延伸
cmaster rtpluspcr 系統(tǒng)顯示出一種依賴于模板rna 量的寬廣的產物產量動力學范圍。能從低至10 pg 的hela 總rna中檢測到α微管蛋白mrna。
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